唾液腺恶性多形性腺瘤癌相关成纤维细胞系及构建方法

本发明涉及一种构建生物材料的方法，尤其是涉及一种构建肿瘤相关成纤维细胞系的方法，以及获得细胞系。

背景技术：

1、多形性腺瘤(pleomorphic adenoma，pa)是唾液腺最常见的良性肿瘤之一，因其长病程较长或者易复发具有恶变潜能，恶变为恶性多形性腺瘤(malignant pleomorphicadenoma，mpa)。mpa是唾液腺恶性肿瘤中第三好发的恶性肿瘤，约占所有唾液腺恶性肿瘤的12％。目前mpa的治疗方法主要为手术切除，配合术后放、化疗，但mpa呈侵犯性生长，常转移至颈淋巴结、肺、肝或骨等部位，患者预后不佳。

2、肿瘤的发生发展与多因素有关，近年肿瘤微环境作为重要因素成为研究热点之一。肿瘤微环境主要是指与肿瘤的发生、发展和转移等相关的肿瘤细胞所处的内外环境，是一个高度复杂的生态环境，其包括肿瘤细胞、各类基质细胞、免疫细胞和各类细胞因子等。大量文献证明基质细胞(成纤维细胞、癌相关成纤维细胞和血管内皮细胞等)在肿瘤微环境中起重要作用，尤其是癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts，cafs)。在细胞间质较多的肿瘤中，cafs有着重要地位，没有其参与的肿瘤微环境将难以保证实验结果的准确性。cafs通过激活自分泌和旁分泌信号，参与的发生、发展、转移和侵袭，发挥重要作用。因此，研究cafs的特征、功能和作用机制等对阐明mpa的转移和侵袭等、开发新型具有治疗效果的药物和探索新的诊疗方案具有重要的意义。

3、目前，大量不同类型的肿瘤证实存在cafs。由于mpa肿瘤样本量相对常见恶性肿瘤较少，加之cafs提取和传代成功率低，这些给mpa的cafs细胞系的建立带来了很大难度，因此未见报道成功构建mpa的cafs细胞系，这也阻碍了人们对mpa的了解和研究。

技术实现思路

1、本发明的一个目的在于提供一种细胞系，经细胞培养构建所得，利于研究唾液腺恶性多形性腺瘤。

2、本发明的另一个目的在于提供一种构建唾液腺恶性多形性腺瘤癌相关成纤维细胞系的方法，已获得传代稳定的细胞系。

3、本发明的再一个目的在于提供一种细胞系在制备治疗唾液腺恶性多形性腺瘤药物中的应用。

4、本发明的又一个目的在于提供一种细胞系在制备治疗唾液腺恶性多形性腺瘤医疗器械中的应用。

5、一种细胞系，从唾液腺恶性多形性腺瘤组织中构建获得，保藏号cctcc noc2023340，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉 武汉大学，保藏日期2023年11月8日，分类命名人唾液腺恶性多形性腺瘤癌相关成纤维细胞mpa-caf。

6、一种唾液腺恶性多形性腺瘤癌相关成纤维细胞系的构建方法，包括：

7、将剪碎的组织块于dmem培养基中清洗(如：2-3遍)，将组织块移入至t25培养瓶中，加1.5ml第一培养基后将培养瓶倒置于培养箱中培养(如：37℃，二氧化碳浓度5％)8～10h后，再次颠倒培养瓶继续培养8-10h；

8、之后再加入第一培养基1.5-2ml，继续培养24h-48h后，弃去第一培养基，用pbs清洗细胞一次，再加入4-5ml第二培养基；

9、待癌上皮细胞和cafs细胞均爬出后，应用差速贴壁法，重复多次(如：2～3次)进行分离上皮和cafs细胞，最终得到稳定传代的cafs细胞。

10、本发明实施的差速贴壁法，采用胰酶消化液消化细胞，显微镜下观察细胞部分变圆即终止消化，磕打培养瓶，将悬浮的细胞移至新的培养瓶。先悬浮消化的细胞为cafs，于37℃、5％co2饱和湿度培养箱中培养。剩余未消化悬浮细胞(大部分为mpa)继续于37℃，5％co2饱和湿度培养箱中培养。如此，反复操作，直至培养的细胞均为cafs。

11、消化该cafs细胞用胰酶作用1-2min即可，轻拍培养皿壁，终止消化。

12、之后，使用第二培养基进行传代培养，每次传代比例1:3～1:2，传代至p30。

13、本发明的构建方法，第一培养基系以dmem高糖培养基为基础培养基，还加入20％胎牛血清和1％青霉素-链霉素溶液。

14、本发明的构建方法，第二培养基系以dmem高糖培养基为基础培养基、还加入10％胎牛血清、5ng/ml bfgf、5ng/ml egf和1％青霉素-链霉素溶液。

15、本发明不仅成功证实存在mpa的cafs，且对cafs进行传代培养至p30，成功建立细胞系。

16、本发明方法获得cafs细胞系，为临床进一步研究mpa肿瘤的治疗手段提供了实验条件，比如：作为实验材料用于药物的制取，即在新药开发中用于筛选具有抑癌作用的新分子，或者开发临床上治疗mpa的手术器械等。

技术特征：

1.一种细胞系，其特征在于从唾液腺恶性多形性腺瘤组织中构建获得，保藏号cctccno c2023340。

2.一种唾液腺恶性多形性腺瘤癌相关成纤维细胞系，其特征在于按如下方法构建而得：

3.根据权利要求2所述的细胞系，其特征在于每次传代比例1:3～1:2。

4.根据权利要求2所述的细胞系，其特征在于所述的第一培养基系以dmem高糖培养基为基础培养基，加入20％胎牛血清。

5.根据权利要求4所述的细胞系，其特征在于所述的第一培养基还加入1％青霉素-链霉素溶液。

6.根据权利要求2所述的细胞系，其特征在于所述的第二培养基系以dmem高糖培养基为基础培养基，加入10％胎牛血清。

7.根据权利要求5所述的细胞系，其特征在于所述的第二培养基还加入5ng/ml bfgf、5ng/mlegf和1％青霉素-链霉素溶液。

8.根据权利要求1或2所述的细胞系在唾液腺恶性多形性腺瘤迁移和侵袭研究中应用。

9.根据权利要求1或2所述的细胞系在制备治疗唾液腺恶性多形性腺瘤药物中的应用。

10.根据权利要求1或2所述的细胞系在治疗唾液腺恶性多形性腺瘤医疗器械中的应用。

技术总结
一种唾液腺恶性多形性腺瘤癌相关成纤维细胞系，对取自唾液腺恶性多形性腺瘤组织进行体外细胞培养并传代至P30，而构建获得细胞系，保藏于CCTCC，编号为CCTCC NO:C2023340。本发明的CAFs细胞系，为临床唾液腺恶性多形性腺瘤迁移、侵袭研究，以及进一步研究MPA肿瘤的治疗手段提供了实验条件，比如：作为实验材料用于药物的制取，即在新药开发中用于筛选具有抑癌作用的新分子，或者开发临床上治疗MPA的手术器械等。

技术研发人员：田臻,李江,陈宛灵,顾挺,张春叶,张莺,薛俊青
受保护的技术使用者：上海交通大学医学院附属第九人民医院
技术研发日：
技术公布日：2024/4/7