一组检测出血热病原体的分子靶标及其应用的制作方法

本发明涉及出血热病毒诊断，具体地，涉及一组检测出血热病原体的分子靶标及其应用。

背景技术：

1、出血热(hemorrhagic fever，hf)，又称病毒性出血热(viral hemorrhagicfevers，vhfs)，是由多种病毒(如登革病毒等)引起的一类急性传染病，典型的临床表现为发热、出血、皮肤及黏膜出现瘀斑或瘀点、不同程度的脏器损害，部分病毒性出血热伴有不同程度的低血压和休克。出血热病原体种类繁多如马尔堡病毒、裂谷热病毒、黄热病毒、西尼罗河病毒、登革病毒、寨卡病毒等，传播方式多样，主要经蚊、白蛉等生物传播，部分病毒如马尔堡病毒也可通过患者的血液、分泌物等体液传播。病毒进入人体后，损伤血管壁及凝血功能，引起各脏器出血，进入血液激活产内生致热原的细胞，引起发热。现有的诊断方法一般采用实验室生理生化指标及抗原抗体检测确诊，在感染前期及潜伏期不能确定是否感染出血热相关病原体，因此迫切需要一种灵敏和精确检测出血热的病原体的方法。

2、实时荧光pcr是基于荧光共振能量转移(fret)原理的技术，是病原体核酸检测常用方法之一，可用于实验室检查、流行病学研究、排除诊断等。该方法灵敏度高、特异性好，可以准确快速提供目标病毒的检测结果。其中，以taqman荧光标记探针为基础的实时荧光pcr技术利用热稳定dna聚合酶taq酶在具有5’-3’方向的聚合酶活性的同时，还具有对聚合延伸过程中遇到的与靶序列结合的核苷酸序列的5’-3’方向的核酸外切酶活性。taqman荧光探针在5’和3’端分别标记荧光发射基团和淬灭基团，探针的3’末端被磷酸化以防止探针在pcr扩增过程中被延伸。当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用即被解除，荧光发射基团发射波长处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板dna发生杂交，延伸期taq酶随引物延伸沿dna模板移动，当移动至探针位置时，taq dna多聚酶的5’核酸外切酶活性能降解特异性荧光标记探针，荧光基团和淬灭基团分离，荧光发射出来。但是现有技术中对出血热相关病原体的实时荧光pcr检测方法大多只能检测单个或两个病原体，无法实现同时精准检测出多个出血热病原体。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中无法灵敏、精确且同时检测多个出血热的病原体的问题，本发明提供了一组检测出血热病原体的分子靶标及其应用。

2、本发明的第一个目的是提供一组检测出血热病原体的分子靶标。

3、本发明的第二个目的是提供检测所述分子靶标的试剂在制备检测出血热病原体的试剂盒中的应用。

4、本发明的第三个目的是提供一组重组质粒。

5、本发明的第四个目的是提供所述重组质粒在制备检测出血热病原体的试剂盒中的应用。

6、本发明的第五个目的是提供检测所述分子靶标的引物。

7、本发明的第六个目的是提供所述引物在制备检测出血热病原体的产品中的应用。

8、本发明的第七个目的是提供检测所述分子靶标的引物探针组合物。

9、本发明的第八个目的是提供一种检测出血热病原体的试剂盒。

10、为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

11、本发明根据不同出血热病原的检测靶标在ncbi库中的全长基因组序列、cds、partial sequence和其它相似基因序列，经过基因比对选择保守区和特异性区段筛选设计检测引物和探针，并进行特异性分析、二级结构分析和二聚体分析。

12、本发明请求保护以下内容：

13、一组检测出血热病原体的分子靶标，所述分子靶标的核苷酸序列如seq id no：28～33所示，所述出血热的病原体为马尔堡病毒、裂谷热病毒、黄热病毒、西尼罗河病毒、登革病毒和寨卡病毒。其中，马尔堡病毒的靶标序列的核苷酸序列如seq id no：28所示，裂谷热病毒的靶标序列的核苷酸序列如seq id no：29所示，黄热病毒的靶标序列的核苷酸序列如seq id no：30所示，西尼罗河病毒的靶标序列的核苷酸序列如seq id no：31所示，登革病毒的靶标序列的核苷酸序列如seq id no：32所示，寨卡病毒的靶标序列的核苷酸序列如seq id no：33所示。

14、检测所述分子靶标的试剂在制备检测出血热原体的试剂盒中的应用，所述靶标序列的核苷酸序列如seq id no：28～33所示，所述出血热病原体为马尔堡病毒、裂谷热病毒、黄热病毒、西尼罗河病毒、登革病毒和寨卡病毒。

15、一组重组质粒，所述重组质粒为连接有核苷酸序列如seq id no：28～33所示的分子靶标的质粒。

16、优选地，所述重组质粒以pmd18-t质粒为骨架。

17、更优选地，所述重组质粒以pmd18-t质粒为骨架，核苷酸序列如seq id no：28～33所示的分子靶标中的任意一个设置于hindiii位点和bamhi位点之间，即mbv阳性质粒、rvfv阳性质粒、yfv阳性质粒、wnv阳性质粒、den阳性质粒和zikv阳性质粒。

18、任一所述重组质粒在制备检测出血热病原体的试剂盒中的应用，所述重组质粒作为阳性对照品和/或阳性标准品。其中，连接有核苷酸序列如seq id no：28所示的分子靶标的质粒作为马尔堡病毒的阳性对照品和/或阳性标准品；连接有核苷酸序列如seq id no：29所示的分子靶标的质粒作为裂谷热病毒的阳性对照品和/或阳性标准品；连接有核苷酸序列如seq id no：30所示的分子靶标的质粒作为黄热病毒的阳性对照品和/或阳性标准品；连接有核苷酸序列如seq id no：31所示的分子靶标的质粒作为西尼罗河病毒的阳性对照品和/或阳性标准品；连接有核苷酸序列如seq id no：32所示的分子靶标的质粒作为登革病毒的阳性对照品和/或阳性标准品；连接有核苷酸序列如seq id no：33所示的分子靶标的质粒作为寨卡病毒的阳性对照品和/或阳性标准品。

19、优选地，所述重组质粒以pmd18-t质粒为骨架。

20、更优选地，所述重组质粒以pmd18-t质粒为骨架，核苷酸序列如seq id no：28～33所示的分子靶标中的任意一个设置于hindiii位点和bamhi位点之间，即mbv阳性质粒、rvfv阳性质粒、yfv阳性质粒、wnv阳性质粒、den阳性质粒和zikv阳性质粒。

21、检测所述核苷酸序列如seq id no：28～33所示的分子靶标的引物。

22、优选地，所述引物的核苷酸序列如seq id no：1～2、seq id no：4～5、seq id no：7～8、seq id no：10～11、seq id no：13～14和seq id no：16～17所示。其中，所述核苷酸序列如seq id no：1～2所示的引物，检测马尔堡病毒；所述核苷酸序列如seq id no：4～5所示的引物，检测裂谷热病毒；所述核苷酸序列如seq id no：7～8所示的引物，检测黄热病毒；所述核苷酸序列如seq id no：10～11所示的引物，检测西尼罗河病毒；所述核苷酸序列如seq id no：13～14所示的引物，检测登革病毒；所述核苷酸序列如seq id no：16～17所示的引物，检测寨卡病毒。

23、任一所述引物在制备检测出血热病原体的产品中的应用也应在本发明的保护范围之内。

24、任一所述引物在制备检测出血热病原体的试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内。

25、检测所述核苷酸序列如seq id no：28～33所示的分子靶标的引物探针组合物，包含引物和探针，所述引物为任一上述引物。

26、优选地，所述引物的核苷酸序列如seq id no：1～2、seq id no：4～5、seq id no：7～8、seq id no：10～11、seq id no：13～14和seq id no：16～17所示。

27、更优选地，所述探针的核苷酸序列如seq id no：3、seq id no：6、seq id no：9、seq id no：12、seq id no：15和seq id no：18所示。其中，所述核苷酸序列如seq id no：3所示的探针，检测马尔堡病毒；所述核苷酸序列如seq id no：6所示的探针，检测裂谷热病毒；所述核苷酸序列如seq id no：9所示的探针，检测黄热病毒；所述核苷酸序列如seq idno：12所示的探针，检测西尼罗河病毒；所述核苷酸序列如seq id no：15所示的探针，检测登革病毒；所述核苷酸序列如seq id no：18所示的探针，检测寨卡病毒。

28、进一步优选地，所述引物探针组合物包含引物探针组1～3；

29、所述引物探针组1包含核苷酸序列如seq id no：1～2和seq id no：16～17所示的引物以及核苷酸序列如seq id no：3和seq id no：18所示的探针；

30、所述引物探针组2包含核苷酸序列如seq id no：4～5和seq id no：13～14所示的引物以及核苷酸序列如seq id no：6和seq id no：15所示的探针；

31、所述引物探针组3包含核苷酸序列如seq id no：7～8和seq id no：10～11所示的引物以及核苷酸序列如seq id no：9和seq id no：12所示的探针；

32、所述引物探针组1～3各组间的探针的5’端设有不同的荧光基团，3’端设有淬灭基团；所述荧光基团为texas red、cy5或fam；所述淬灭基团为bhq1或bhq2。

33、更进一步优选地，所述引物探针组1的5’端设有荧光基团fam，3’端设有淬灭基团bhq1；所述引物探针组2的5’端设有荧光基团cy5，3’端设有淬灭基团bhq2；所述引物探针组3的5’端设有荧光基团texas red，3’端设有淬灭基团bhq2。

34、任一所述引物或任一所述引物探针组合物在制备检测出血热的试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内。

35、一种检测出血热病原体的试剂盒，包含检测所述核苷酸序列如seq id no：28～33所示的分子靶标的试剂。

36、优选地，所述试剂包含检测所述分子靶标的引物。

37、更优选地，所述引物的核苷酸序列如seq id no：1～2、seq id no：4～5、seq idno：7～8、seq id no：10～11、seq id no：13～14和seq id no：16～17所示。

38、更优选地，所述试剂还包含检测所述分子靶标的探针。

39、进一步优选地，所述探针的核苷酸序列如seq id no：3、seq id no：6、seq id no：9、seq id no：12、seq id no：15和seq id no：18所示。

40、优选地，所述试剂包含检测所述分子靶标的引物探针组合物。

41、更优选地，所述引物探针组合物中，引物的核苷酸序列如seq id no：1～2、seq idno：4～5、seq id no：7～8、seq id no：10～11、seq id no：13～14和seq id no：16～17所示。

42、进一步优选地，所述引物探针组合物中，所述探针的核苷酸序列如seq id no：3、seq id no：6、seq id no：9、seq id no：12、seq id no：15和seq id no：18所示。

43、更进一步优选地，所述引物探针组合物包含引物探针组1～3；

44、所述引物探针组1包含核苷酸序列如seq id no：1～2和seq id no：16～17所示的引物以及核苷酸序列如seq id no：3和seq id no：18所示的探针；

45、所述引物探针组2包含核苷酸序列如seq id no：4～5和seq id no：13～14所示的引物以及核苷酸序列如seq id no：6和seq id no：15所示的探针；

46、所述引物探针组3包含核苷酸序列如seq id no：7～8和seq id no：10～11所示的引物以及核苷酸序列如seq id no：9和seq id no：12所示的探针；

47、所述引物探针组1～3各组间的探针的5’端设有不同的荧光基团，3’端设有淬灭基团；所述荧光基团为texas red、cy5或fam；所述淬灭基团为bhq1或bhq2。

48、再进一步优选地，所述引物探针组1的5’端设有荧光基团fam，3’端设有淬灭基团bhq1；所述引物探针组2的5’端设有荧光基团cy5，3’端设有淬灭基团bhq2；所述引物探针组3的5’端设有荧光基团texas red，3’端设有淬灭基团bhq2。

49、再进一步优选地，所述引物探针组1～3的引物工作浓度为0.08μm～0.12μm；引物探针组1～3的探针工作浓度为0.08μm～0.12μm。

50、最优选地，所述引物探针组1～3的引物工作浓度为各为0.1μm；引物探针组1～3的探针工作浓度各为0.1μm。

51、优选地，所述试剂盒还包含连接有核苷酸序列如seq id no：28～33所示的分子靶标的重组质粒，所述重组质粒作为阳性对照品和/或阳性标准品。

52、更优选地，所述重组质粒以pmd18-t质粒为骨架。

53、进一步优选地，所述重组质粒以pmd18-t质粒为骨架，核苷酸序列如seq id no：28～33所示的分子靶标中的任意一个设置于hindiii位点和bamhi位点之间。

54、优选地，所述试剂盒还包含外源性内标，所述外源性内标为连接有外源性内标基因的重组质粒。本发明对外源性内标基因不做特殊限定，如番木瓜蛋白酶基因、hordeumvulgare dehydrin基因(即dhn基因)等常规的外源性内标基因，均可实现本发明检测出血热的目的。

55、更进一步优选地，所述外源性内标基因为dhn基因，ncbi号：af043095.1。

56、再进一步优选地，所述重组质粒以pmd18-t质粒为骨架。

57、最优选地，所述重组质粒以pmd18-t质粒为骨架，dhn基因的序列(seq id no：36)设置于hindiii位点和bamhi位点之间，即dhn质粒。

58、更进一步优选地，所述引物探针组合物还包含检测所述dhn基因的引物组合4，包含核苷酸序列如seq id no：25～26所示的引物和核苷酸序列如seq id no：27所示的探针。

59、再进一步优选地，所述核苷酸序列如seq id no：27所示的探针的5’端荧光基团为vic，3’淬灭基团为bhq1。

60、再进一步优选地，引物探针组4中，核苷酸序列如seq id no：25～26所示的引物工作浓度为0.08μm～0.12μm；核苷酸序列如seq id no：27所示的探针工作浓度为0.08μm～0.12μm。

61、最优选地，引物探针组4中，核苷酸序列如seq id no：25～26所示的引物工作浓度各为0.1μm；核苷酸序列如seq id no：27所示的探针工作浓度为0.1μm。

62、优选地，所述试剂盒还包含pcr buffer和pcr反应酶。

63、更优选地，所述pcr buffer包含tris-hcl、吐温20、kcl、(nh4)2so4和mgcl2。

64、进一步优选地，所述pcr buffer还包含depc h2o。

65、更优选地，pcr反应酶包含热启动taq酶、taq酶、c-mmlv酶、dntps和rnasin。

66、进一步优选地，pcr反应酶还包含depc水。

67、更进一步优选地，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：

68、s1.获得待测样本的核酸；

69、s2.以待测样本的核酸作为模板，使用上述引物探针组合物、pcr buffer和pcr反应酶制备反应体系，进行荧光定量pcr扩增。

70、本发明对提取核酸的方法没有特殊限定，一般可用实验室常规方法或核酸提取试剂盒提取待测样本的核酸。

71、再进一步优选地，步骤s2中，荧光定量pcr扩增的程序为：48～52℃，2分钟；93～97℃，2分钟；93～97℃，5秒，58～62℃，10～35秒，45个循环。

72、最优选地，步骤s2中，所述荧光定量pcr扩增的程序为：50℃，2分钟；95℃，2分钟；95℃，5秒，60℃，10秒，45个循环，收集荧光。

73、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

74、本发明提供了检测六项出血热病原体的引物、引物探针组合物与试剂盒，并且添加外源性内标对核酸提取过程及pcr扩增过程进行监控提高结果准确度，优化扩增体系加快检测速度，检测限低至400copies/ml，灵敏度高，重复性好，特异性强，为出血热病原的检测提供新的技术选择。