水稻OsOGG1基因在调控水稻对稻瘟病抗性中的应用

本发明属于分子育种，具体涉及一种水稻osogg1基因在调控水稻对稻瘟病抗性中的应用。

背景技术：

1、水稻是中国最重要的粮食作物之一，也是我国实施粮食安全战略不可或缺的基础。由稻瘟病菌引发的稻瘟病是威胁我国水稻安全生产的主要病害之一，其在水稻的各个生长发育时期都有可能发生。实践证明，发掘水稻稻瘟病抗性基因，培育和利用含抗性基因的广谱持久抗病品种是最为经济、可持续、环保的稻瘟病防治措施。具有稻瘟病抗性的地方水稻种质资源是挖掘抗病基因并向水稻栽培品种导入从而防治稻瘟病的宝贵资源，但这样的种质资源数量有限，且传统的基因导入育种方式耗时较长。另外，长期种植含单个抗性(r)基因的抗病品种，容易由于高选择压使稻瘟病菌发生突变，形成免疫逃逸，让抗病品种丧失抗性。因此，挖掘更多的抗病基因尤其是具有广谱抗性的基因，或利用其他方法如编辑稻瘟病抗性负调控基因从而使水稻具有稻瘟病抗性具有重要意义。

2、植物在逆境条件下通常会伴随活性氧(reactive oxygen species,ros)的产生，ros是普遍存在的强活性氧化剂，可以氧化细胞中如脂质、蛋白质和核酸等在内的大多数大分子物质，若不及时清除，则会造成氧化胁迫，使细胞受到损伤。多年来的研究还发现ros是重要的细胞应激物质，可作为信号分子参与调节植物对各种生物与非生物胁迫的响应。如ros在植物病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,pamps)触发的免疫(pti)和病原效应物(effector)触发的免疫(eti)过程中都发挥着重要作用。水稻在防卫稻瘟病菌的过程中，其模式识别受体(prrs)可通过感知pamps激活多种免疫反应，包括快速而强烈地产生ros，从而触发水稻的pti。另外，当pti被病原菌effector打破时，水稻细胞内的免疫受体可以识别特异性的effector，激活ros爆发、胼胝质沉积、病程相关蛋白的诱导表达和程序性细胞死亡等一系列信号通路，最终导致过敏反应(hypersensitiveresponses,hr)，完成eti过程，抵抗病原菌。

3、ros是自发和诱导dna损伤的主要来源，产生包括氧化碱基衍生物和链断裂等损伤类型。7,8-二氢-8-氧鸟嘌呤(8-oxo-g)是dna中一种主要的氧化碱基损伤，8-oxo-g不仅能与胞嘧啶(c)配对，还能与腺嘌呤(a)配对，从而可能造成gc碱基对至ta碱基对的颠换突变。8-oxo-g通过碱基切除修复(ber)途径进行修复。生物体的ber途径由dna糖基酶引发，并继续通过其他协同途径在细胞中最终完成。作用于8-oxo-g的dna糖基酶分为两个不同的结构家族，二者的原型成员是大肠杆菌的甲酰胺嘧啶-dna糖基化酶(formamidopyrimidine-dnaglycosylase,fpg)和酵母的8-羟基鸟嘌呤dna糖基化酶(8-oxoguanine dna glycosylase/lysase,ogg1)。ogg1同源物在除细菌外的许多真核生物和古细菌中被检测到。fpg同源物在细菌、真菌和植物中被发现，但在动物或酵母细胞中尚未发现。研究发现拟南芥ogg1和fpg都可以直接作用于dna中的8-oxo-g，在切除8-oxo-g的ber途径中发挥功能，且dna氧化损伤的增加仅在拟南芥fpg/ogg1双突变体中被检测到，而在fpg或ogg1单突变体中未被检测到，这表明二者中一个的缺陷可能由另一个来补偿。ogg1在细菌、酵母菌和哺乳动物中的功能研究得较多，而植物ogg1的生物学功能仅在拟南芥和苜蓿中被报道，对水稻osogg1基因的生物学功能也仅有初步探索和分析(何艳冰,2015；金如意，2017)，ogg1具有参与植物先天免疫系统的功能之前从未被揭示过，osogg1在水稻抗稻瘟病遗传改良中的利用途径之前亦尚不明确。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供水稻osogg1基因在水稻抗稻瘟病中的应用。

2、本发明的技术方案如下：

3、水稻osogg1基因或其编码的蛋白在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用，所述水稻osogg1基因为以下物质中的至少一种：

4、(1)如seq id no.1所示的核苷酸序列；

5、(2)如seq id no.2所示的cds核苷酸序列；

6、(3)与seq id no.1或seq id no.2所示的核苷酸序列功能相当的核苷酸序列；

7、所述水稻osogg1基因编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。

8、本发明还要求保护水稻osogg1基因或其编码的蛋白在水稻抗稻瘟病育种中的应用。

9、本领域技术人员可以通过以下方法获得与本发明提供的osogg1等同的基因：(1)根据osogg1基因序列信息设计引物，利用pcr扩增的方法从水稻基因组dna、cdna、水稻基因组文库或cdna文库中获取；(2)利用基因的功能保守区域序列设计探针，通过dna探针杂交结合酶切的方式获得；(3)通过化学合成法的方式获得。

10、本发明还提供一种重组载体，所述重组载体为rna干扰(rnai)载体和/或基因编辑载体，包括水稻osogg1基因片段的部分区段，所述水稻osogg1基因片段为以下物质中的至少一种：

11、(1)如seq id no.1所示的核苷酸序列；

12、(2)如seq id no.2所示的cds核苷酸序列；

13、(3)与seq id no.1或seq id no.2所示的核苷酸序列功能相当的核苷酸序列；

14、所述水稻osogg1基因片段编码蛋白质的氨基酸序列如seq id no.3所示；所述rnai载体的空载体为panda载体；所述基因编辑载体的空载体为pylcrispr/cas9-mtmono载体。

15、本发明还提供一种细胞，所述细胞包含如上所述的重组载体；所述细胞为大肠杆菌dh5α细胞和/或农杆菌eha105细胞。所述细胞包含水稻osogg1基因片段的部分区段，所述水稻osogg1基因片段为以下物质中的至少一种：

16、(1)如seq id no.1所示的核苷酸序列；

17、(2)如seq id no.2所示的cds核苷酸序列；

18、(3)与seq id no.1或seq id no.2所示的核苷酸序列功能相当的核苷酸序列；

19、所述水稻osogg1基因片段编码蛋白质的氨基酸序列如seq id no.3所示。

20、本发明还提供一种引物对，所述引物对的序列如seq id no.4、seq id no.5所示。

21、一种试剂盒，包括上述引物对。

22、本发明还要求保护上述重组载体、上述细胞、上述引物对、上述试剂盒在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用。

23、本发明还要求保护上述重组载体、上述细胞、上述引物对、上述试剂盒在水稻抗稻瘟病育种中的应用。

24、本发明还提供一种抗稻瘟病转基因水稻的构建方法，将上述重组载体、上述农杆菌eha105细胞利用农杆菌介导的遗传转化方法转化水稻植株，获得抗稻瘟病转基因水稻；所述重组载体和农杆菌eha105细胞包含水稻osogg1基因片段的部分区段，所述水稻osogg1基因片段为以下物质中的至少一种：

25、(1)如seq id no.1所示的核苷酸序列；

26、(2)如seq id no.2所示的cds核苷酸序列；

27、(3)与seq id no.1或seq id no.2所示的核苷酸序列功能相当的核苷酸序列；

28、所述水稻osogg1基因片段编码蛋白质的氨基酸序列如seq id no.3所示。

29、本发明还要求保护一种利用上述构建方法得到的抗稻瘟病转基因水稻，所述抗稻瘟病转基因水稻为osogg1基因功能缺失或者osogg1基因表达水平下降的转基因水稻。

30、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

31、(1)水稻osogg1具有参与调控水稻先天免疫系统的功能，在水稻材料中降低osogg1基因表达水平或者敲除osogg1基因(即使osogg1功能丧失)，可显著提高水稻对稻瘟病的抗性。

32、(2)osogg1基因功能缺失或者表达水平显著下降的转基因水稻材料的稻瘟病抗性增强，但在农艺性状上与野生型水稻无明显差异，可在生产上应用。

33、(3)实验室前期研究发现osogg1的表达水平显著降低并没有增加水稻基因组dna中8-oxo-g的水平，这可能与其他糖基酶如fpg等的功能补偿有关，这也可能是osogg1的功能缺失并未造成水稻基本农艺性状改变的原因，但osogg1的功能突变可以显著增强水稻对稻瘟病的抗性。

34、说明书附图

35、图1为osogg1基因克隆过程中扩增产物的电泳检测图。

36、图2为osogg1蛋白保守结构域预测图。

37、图3为osogg1rnai转基因植株的阳性转基因植株鉴定电泳图。

38、图4为osogg1rnai转基因植株中osogg1的表达量检测结果图。

39、图5为两个pylcrispr/cas9-osogg1基因编辑载体构建过程图，其中(a)sgrna表达盒第一轮扩增产物；(b)sgrna表达盒第二轮扩增产物；(c)靶点1的菌落pcr产物；(d)靶点2的菌落pcr产物；(e)重组载体pylcrispr-cas9-osogg1的酶切验证图。

40、图6为喷雾接种法鉴定osogg1rnai转基因植株的稻瘟病抗性表型结果。

41、图7为离体叶片划伤接种法鉴定osogg1rnai转基因植株和突变体植株的稻瘟病抗性相关结果，其中(a)osogg1基因的rnai水稻材料的抗病表型结果；(b)osogg1基因的突变体水稻材料的抗病表型结果；(c)osogg1基因的rnai水稻材料的病斑面积统计结果；(d)osogg1基因的突变体水稻材料的病斑面积统计结果。

42、图8为osogg1相关转基因水稻植株的田间稻瘟病抗性鉴定结果，其中(a、d)分别为超表达株系的发病表型和相对病斑面积统计结果；(b、e)分别为rnai株系的发病表型和相对病斑面积统计结果；(c、f)分别为突变体株系的发病表型和相对病斑面积统计结果。