基于cfDNA筛查胎儿ACH的基因检测试剂盒及系统的制作方法

本发明属于生物与新医药，具体涉及高通量测序技术检测孕妇外周血浆筛查胎儿遗传病，特别涉及基于cfdna筛查胎儿ach的基因检测试剂盒及系统。

背景技术：

1、单基因病是指由一对等位基因控制的疾病或临床病理表现，根据致病基因所在的染色体可将其分为常染色体遗传病、性染色体遗传病和线粒体遗传病，目前已明确发病机制的单基因病有近5000多种，大多数单基因病无法治愈或治疗成本高。当前每年出生缺陷儿数量不断增加，单基因病是导致新生儿出现缺陷的主要原因之一，进行产前检测是预防患基因病或提前进行临床干预最有效的方法。目前检测单基因病最常用的方法是通过绒毛膜取样和羊膜腔穿刺获取细胞进行检测，但两种方法均为有创检测，存在流产风险，随着孕妇外周血中胎儿游离dna的发现，基于无创产前检测单基因病已成为主要趋势。

2、软骨发育不全(achondroplasia，ach)(omim#100800)是导致非匀称性身材矮小的罕见疾病，此病于1878年首次报道，活产婴儿发病率为1∶17 000～1∶28 000，主要表现为四肢长骨近端短缩、大头畸形以及特殊面容(前额突出、面中部发育不良呈现后凹和鼻梁塌陷)。ach属于常染色体显性遗传性疾病，成纤维细胞生长因子受体3(fibroblast growthfactor receptor 3，fgfr3)基因(omim#134934)是其主要致病基因。大约80％的患儿由新发变异所引起，其发生与父亲年龄较大有关，另外约20％是由家族遗传所致。fgfr3基因常见的致病性变异为c.1138g>a(p.gly380arg)和c.1138g>c(p.gly380arg)，约98％的ach患儿出现c.1138g>a基因改变，少数为c.1138g>c变异。

3、目前基于高通量测序技术对单基因病进行无创产前检测的技术手段主要有扩增子测序和液相杂交捕获测序，扩增子测序是一种高特异性的靶向测序方法，通常采用多重pcr的方式进行富集，能够针对基因特定区域的点突变、插入缺失、结构变异进行检测，相较于液相杂交捕获测序方法，扩增子测序优势在于对起始模板量要求低，特异性强，检验操作难度低、时间短，数据量要求低可降低成本等。

4、扩增子测序虽有上述所提到的优点，但其本身也存在无法避免的技术缺点，采用多重pcr扩增的方法进行靶向富集可能会出现扩增偏好性，同时pcr过程中可能会出现碱基错配、非特异性扩增以及测序系统引入的误差，影响低频突变结果的准确性。此外，当前扩增子测序主流技术需要2步pcr建库，甚至是pcr后再进行常规的ngs文库构建，操作繁琐、检测周期长、成本高且容易引入实验室污染。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种基于cfdna筛查胎儿ach的基因检测试剂盒及系统。

2、本发明所采取的技术方案是：

3、本发明的第一个方面，提供：

4、一种筛查胎儿ach的基因检测试剂盒，包括反应体系，其引物组如下：

5、第一引物，依次包括测序平台上游接头引物部分引物序列、唯一分子标记和捕获软骨发育不全基因突变的靶标特异性上游引物序列，所述靶标特异性上游引物序列的核苷酸序列为：ccaccaccaggatgaacagg；

6、第二引物，依次包括测序平台下游接头引物部分引物序列反向互补序列和捕获软骨发育不全基因突变的靶标特异性下游引物序列，所述靶标特异性下游引物序列的核苷酸序列为：catgtctttgcagccgaggagg；

7、第三引物，为测序平台上游通用序列；

8、第四引物，依次包括测序接头3’端通用引物、index序列、测序平台下游接头5’端通用引物序列。

9、在一些基因检测试剂盒的实例中，所述第一引物的测序平台上游接头引物部分的序列为：gaacgacatggctacgatccgactt。

10、在一些基因检测试剂盒的实例中，所述第二引物测序平台下游接头引物部分的序列为：gaccgcttggcctccgactt。

11、在一些基因检测试剂盒的实例中，所述第二引物的序列为：gaccgcttggcctccgacttcatgtctttgcagccgaggagg。

12、在一些基因检测试剂盒的实例中，所述第一引物的序列为：gaacgacatggctacgatccgacttnnnnnnnnccaccaccaggatgaacagg，其中nnnnnnnn为唯一分子标记。

13、在一些基因检测试剂盒的实例中，所述第三引物的核苷酸序列为：gaacgacatggctacgatccgactt。

14、在一些基因检测试剂盒的实例中，所述第四引物的测序接头3’端通用引物的核苷酸序列为：tgtgagccaaggagttg，所述第四引物的测序平台下游接头5’端通用引物序列为：ttgtcttcctaagaccgcttggcctccgactt。

15、在一些基因检测试剂盒的实例中，所述唯一分子标识的长度为6～10nt，优选8nt。

16、在一些基因检测试剂盒的实例中，所述index序列的长度为6～12nt，优选10nt。

17、在一些基因检测试剂盒的实例中，第三引物的5’端被磷酸化修饰。

18、在一些基因检测试剂盒的实例中，所述反应体系包括：扩增缓冲液、dna聚合酶、纯化磁珠。

19、在一些基因检测试剂盒的实例中，其检测的样本为孕妇外周血。

20、本发明的第二个方面，提供：

21、一种筛查胎儿ach的基因检测系统，包括：

22、cfdna提取装置，用于从孕妇外周血中提取cfdna；

23、pcr扩增装置，用于扩增提取得到的cfdna，其使用的引物如本发明第一个方面所述；

24、文库构建装置，用于纯化pcr扩增装置的扩增产物并构建测序文库；

25、高通量测序装置，对测序文库进行高通量测序；

26、分析装置，基于高通量测序装置得到的测序数据，确定胎儿是否存在ach基因突变。

27、在一些基因检测系统的实例中，pcr扩增时，采用第一引物和第二引物对孕妇外周血血浆中的游离dna模板进行第一轮2个循环的pcr扩增，完成2个循环扩增后，第三引物和第四引物会对所述第一轮扩增产物继续进行第3～35个循环的pcr扩增。

28、本发明的有益效果是：

29、本发明检测孕妇外周血浆筛查胎儿软骨发育不全的基因检测试剂盒，适用于血浆游离dna(cfdna)模板，对起始模板量要求较低，可以通过对孕妇采集外周血进行检测，相较于传统的穿刺采集羊水或组织，对孕妇以及胎儿的伤害更小。

30、本发明所述的基因检测试剂盒，引入了唯一分子标记，使每一条原始模板核酸对应一个umi，最大程度降低测序系统误差和pcr过程引入的错误碱基对测序结果判定的影响，实现从含有大量母体背景的孕妇外周血中准确地进行胎儿软骨发育不全的无创产前筛查。