农杆菌介导的五莲杨遗传转化方法及其检测方法与流程

本发明提供农杆菌介导的五莲杨遗传转化方法及其检测方法，涉及林木基因工程育种。

背景技术：

1、在林木育种应用基因工程，可以改变植物复杂特性，加速树木育种。植物遗传转化有助于培育目标性状的植物品种。根癌农杆菌介导的转化是将外源dna引入植物基因组中进行基因功能和育种研究的有效方法。农杆菌介导的遗传转化受到诸多因素的影响，主要包括植株的基因型、外植体类型、菌株类型、载体与受体间的亲和性、农杆菌侵染方式、预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间及筛选抗生素选择等。

2、五莲杨现存具有种群少、栖息地受限、灭绝风险极高、易受人类干扰等特点，该物种有效种群规模的不断缩小和日益分散将加剧遗传漂变和基因流动减少而导致遗传多样性的丧失。遗传多样性的丧失将大大降低物种适应恶劣环境的能力，并最终加剧其灭绝。通过转基因技术可快速、定向对五莲杨进行遗传改良，在短期内培育出适应气候变化、满足发展需求的五莲杨新品种。但目前缺少五莲杨叶片再分化诱导不定芽培养基，未建立高效遗传转化体系。

技术实现思路

1、本发明提供农杆菌介导的五莲杨遗传转化方法及检测方法，解决了现有技术中缺少五莲杨高效遗传转化体系。

2、本发明是这样实现的，包括如下步骤：

3、(1)以五莲杨成熟叶片的中间部分为外植体，置于添加β-as的农杆菌重悬液中侵染，得到侵染样本；

4、(2)侵染后的叶片放入共培养基中，暗培养3d；

5、(3)共培养结束后，按照“3-3-7-3”方式进行不定芽筛选培养，起初每3d更换一次不定芽筛选培养基培养基，连续操作3次后，每7d更换一次不定芽筛选培养基，直至培养35d；所述不定芽筛选培养基为1/2(nh4no3)ms+0.05mg/l naa+0.5mg/l 6-ba+25g/l蔗糖+7.0g/l琼脂粉；

6、(4)将步骤(3)得到的筛选抗性芽转入生根筛选固体培养基中继续培养35d。

7、作为一种优选的实施方案，步骤(3)中，不定芽筛选所用培养基包括100mg/kan+300mg/l timentin。

8、作为一种优选的实施方案，步骤(4)中，所述生根筛选固体培养基为1/2ms+0.05mg/l naa+100mg/l kan+300mg/l timentin+15g/l蔗糖+7.0g/l琼脂粉。

9、作为一种优选的实施方案，步骤(1)中所述农杆菌重悬液为od600＝0.6农杆菌菌液进行离心，使用2倍体积的1/2(nh4no3)ms液体培养基重悬所得。

10、作为一种优选的实施方案，步骤(2)中，共培养基为1/2(nh4no3)ms+0.05mg/l naa+0.5mg/l6-ba+100μmol/lβ-as+25g/l蔗糖+7.0g/l琼脂粉。

11、作为一种优选的实施方案，步骤(2)中，侵染叶片用无菌滤纸吸干液体，叶背面朝上放入固体共培养基中。

12、作为一种优选的实施方案，步骤(4)得到的抗性生根苗移栽，自然光下培养30d后进行基因检测。

13、作为一种优选的实施方案，包括基因组dna pcr扩增检测：采用ctab法提取抗性植株和对照株叶片总dna，选用pezr-(k)-lc载体设计引物序列35sf/egfpr进行pcr检测，所述35sf为gacgcacaatcccactatc，所述egfpr为ggtgctcaggtagtggttgt，pcr扩增反应体系总体积为30μl，takaratm premix taq 15μl，10μmol/l上下游引物各0.6μl，基因组dna 0.6μl，最后使用ddh2o补至30μl；

14、基因扩增反应程序：95℃预变性3min；95℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸min，设置30个循环；最后72℃充分延伸10min；扩增产物进行4℃保存，使用1.3％琼脂糖凝胶电泳检测。

15、作为一种优选的实施方案，包括qrt-pcr检测egfp基因表达量：

16、利用takara minibest plant rna extraction kit试剂盒提取不同转基因株系及野生型五莲杨幼苗叶片总rna；以反转录后的cdna为模板，荧光蛋白基因设计引物qegfp-f和qegfp-r，所述qegfp-f为gaagaacggcatcaaggt，所述qegfp-r为gctcaggtagtggttgtc，参考sybr premix extaqtmⅱ反应体系，以actin基因为内参基因，进行定量pcr检测，利用2-δδct法分析定量数据，计算不同株系中egfp基因的相对表达量。

17、本发明的有益效果：以五莲杨叶片中间部位为外植体进行农杆菌侵染的直接器官发生方式，高效将外源基因整合入植物的基因组dna转化的遗传转化体系。建立高效诱导五莲杨叶片产生不定芽方法，其平均分化芽数高达38个，是当前白杨和白杨派杂交种的叶片诱导不定芽平均数量(平均为10.32个，变异幅度为2.73个～20个)的3.6倍以上(1.9倍～13.9倍)，组培苗可顺利继代培养。不定芽培养基和生根培养基筛选采用“3-3-7-3”方式为每3天更换一次抗性培养基，连续3次操作后，每7天更换培养基，连续更换3次的筛选培养基更换方式高效获得抗性植株，避免抗生素失效，最大限度过滤假阳性植株，获得高效的稳定遗传转基因株系。建立了叶盘遗传转化方法并获得增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)过表达的转基因五莲杨无性系，使用pcr和qrt-pcr对转基因杨树中的egfp基因进行了分析，阳性转化得率高达47.06％，较当前白杨派平均阳性转化得率高(45.73％)。建立了高效的“双筛法”鉴定阳性植株技术方法，炼苗移栽自然光照培养30d后进行检测，避免结果出现检测“假阳性”，提高检测精准度。本方法与其他白杨派杨树选择叶片为外植体的传统方法相比，转化效率有大幅度提高，同时为后续五莲杨的基因工程育种及遗传改良提供技术支持。

技术特征：

1.一种农杆菌介导的五莲杨遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的五莲杨遗传转化方法，其特征在于，步骤(3)中，所述不定芽筛选所用培养基包括100mg/kan+300mg/l timentin。

3.根据权利要求2所述的一种农杆菌介导的五莲杨遗传转化方法，其特征在于，步骤(4)中，所述生根筛选固体培养基为1/2ms+0.05mg/l naa+25g/l蔗糖+7.0g/l琼脂粉+100mg/l kan+300mg/l timentin。

4.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的五莲杨遗传转化方法，其特征在于，步骤(1)中所述农杆菌重悬液为od600＝0.6农杆菌菌液进行离心，使用2倍体积的1/2(nh4no3)ms液体培养基重悬后稀释2倍所得。

5.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的五莲杨遗传转化方法，其特征在于，步骤(2)中，共培养基为1/2(nh4no3)ms+0.05mg/l naa+0.5mg/l 6-ba+100μmol/lβ-as+25g/l蔗糖+7.0g/l琼脂粉。

6.根据权利要求1至5任意一项所述的农杆菌介导的五莲杨遗传转化方法，其特征在于，步骤(2)中，侵染叶片用无菌滤纸吸干液体，叶背面朝上放入固体共培养基中。

7.如权利要求1所述一种农杆菌介导的五莲杨遗传转化方法的检测方法，其特征在于，步骤(4)得到的抗性生根苗移栽，自然光下培养30d后进行基因检测。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述农杆菌重悬液为od600＝0.6农杆菌菌液进行离心，使用1/2(nh4no3)ms液体培养基重悬后稀释2倍所得。

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，包括基因组dna pcr扩增检测：采用ctab法提取抗性植株和对照株叶片总dna，选用pezr-(k)-lc载体设计引物序列35sf/egfpr进行pcr检测，所述35sf为gacgcacaatcccactatc，所述egfpr为ggtgctcaggtagtggttgt，pcr扩增反应体系总体积为30μl，takaratm premix taq 15μl，10μmol/l上下游引物各0.6μl，基因组dna 0.6μl，最后使用ddh2o补至30μl；

10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，包括qrt-pcr检测egfp基因表达量：

技术总结
本发明提供农杆菌介导的五莲杨遗传转化方法及其检测方法，所述遗传转化方法，包括如下步骤：(1)以成熟叶片中间部分为外植体，置于添加乙酰丁香酮的农杆菌重悬液中侵染，得到侵染样本；(2)侵染后的叶片放入共培养基中进行暗培养，共培养结束后按照“3‑3‑7‑3”方式进行不定芽筛选培养；4)将步骤(3)得到的筛选抗性芽转入生根筛选固体培养基中继续培养35d。检测方法为双筛法，抗性生根苗炼苗移栽自然光下培养30d后，分别进行DNA和RNA水平检验，确定基因的稳定性转化。本发明首次以五莲杨叶片中间部位为外植体进行农杆菌侵染的直接器官发生方式建立高效遗传转化体系，诱导五莲杨叶片产生较多数量的不定芽，提高阳性转化率和阳性植株鉴定效率。

技术研发人员：王艳,鲁仪增,关凌珊,穆艳娟,孙涛,张鹏飞,解孝满,姜春君,赵云朝,仝伯强,赵勇,朱娜娜,厉锋,王睿龙
受保护的技术使用者：山东省林草种质资源中心（山东省药乡林场）
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17