一种高致病性H5N8亚型禽流感假病毒的制备方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种高致病性h5n8亚型禽流感假病毒的制备方法。

背景技术：

1、禽流感病毒(avian influenza viruses，aivs)属于正黏病毒科，基因组由8个分节段的单股负链rna片段基因组成。h5n8亚型禽流感病毒是一种高致病性的禽流感病毒，近年来在全球范围内引起了广泛关注。2009年-2010年间起在我国的家禽中检测到h5n8病毒，其血凝素(hemagglutinin，ha)基因来自亚洲h5n1谱系，但其神经氨酸酶(neuraminidase，na)、核蛋白(nucleoprotein，np)和聚合酶(polymerase basic，pb1)基因均来自未识别的非h5n1病毒，该病毒对禽类具有高致病性，对小鼠具有中度至高度的危险性。2014年，在韩国发现了一种新型重配高致病性h5n8亚型禽流感病毒，自此以后，h5n8亚型禽流感病毒已在亚洲、欧洲、非洲以及北美洲的多个国家和地区检出，对家禽业造成了严重的经济损失，并对野生鸟类的健康构成了威胁。虽然目前该病毒主要影响禽类，但其跨种传播的潜力和对公共卫生的潜在威胁不容忽视。

2、为了更好地理解h5n8病毒的生物学特性和传播机制，研究人员已经开展了大量的实验室研究。在这些研究中，假病毒系统成为了一个重要的工具，因为它可以在不需要高等级生物安全实验室的条件下研究病毒的某些特性。假病毒是一种不具备复制能力的病毒颗粒，它包含了病毒的某些关键蛋白，能够模拟病毒的入侵过程，但不会引起疾病。

技术实现思路

1、本发明的目的在于构建一个高致病性h5n8亚型禽流感病毒的假病毒系统，并验证其在细胞水平上的感染能力以及血清抗体的中和能力。通过这一系统，可以广泛用于人群中和抗体测试，以评估新亚型病毒对人群健康的危险程度，并观察现有疫苗免疫能否对该病毒有交叉免疫保护。此外，假病毒系统的建立也为未来的疫苗开发、抗体检测和药物筛选提供了重要的实验平台，在现代病毒学研究和公共卫生领域具有广泛的用途。

2、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种高致病性h5n8亚型禽流感假病毒的制备方法，包括下列步骤：

3、步骤1：序列号为epi503933，其密码子优化后分别克隆至pcdna3.1(+)载体上，并添加双酶切位点nhei和xhoi，获得以pcdna3.1(+)为载体的h5n8-ha质粒和以pcdna3.1(+)为载体的h5n8-na质粒；

4、步骤2：将以pcdna3.1(+)为载体的h5n8-ha质粒、以pcdna3.1(+)为载体的h5n8-na质粒、pcaggs-tmprss2和pnl4-3.luc.r-e-转入细胞密度为65-75％的hek293t细胞中；同时，加入浓度为1mg/ml的pei max-transfection grade linear polyethyleniminehydrochloride；转染完成后，使用dulbecco’s modified eagle medium维持于37℃、5％co2温箱中15-20h，随后换为添加10％胎牛血清的dmem培养基维持24h后收取上清。

5、由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：

6、本发明成功制备h5n8假病毒，其对293t-st6gal1细胞的感染力为103tcid50/ml，浓缩50倍后血凝活性从16提高到128，经透射电镜可观察到典型的流感病毒颗粒，使用3份h5n8阳性血清样本、3份h5n6阳性血清样本以及9份阴性血清样本，经稀释40倍后进行中和实验，结果显示3份h5n8阳性血清中和活性明显高于其他亚型阳性血清以及阴性血清。本发明成功制备高致病性h5n8亚型禽流感假病毒，为未来的疫苗开发和中和抗体筛选提供了重要的实验平台。

技术特征：

1.一种高致病性h5n8亚型禽流感假病毒的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：

技术总结
一种高致病性H5N8亚型禽流感假病毒的制备方法，包括下列步骤：步骤1：序列号为EPI503933，其密码子优化后分别克隆至pcDNA3.1(+)载体上，并添加双酶切位点NheI和XhoI，获得以pcDNA3.1(+)为载体的H5N8‑HA质粒和以pcDNA3.1(+)为载体的H5N8‑NA质粒；步骤2：将以pcDNA3.1(+)为载体的H5N8‑HA质粒、以pcDNA3.1(+)为载体的H5N8‑NA质粒、pCAGGS‑TMPRSS2和pNL4‑3.Luc.R‑E‑转入细胞密度为65‑75%的HEK293T细胞中；同时，加入浓度为1mg/mL的PEI MAX‑Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride；转染完成后，使用Dulbecco’s Modified Eagle Medium维持于37℃、5%CO<subgt;2</subgt;温箱中15‑20h，随后换为添加10%胎牛血清的DMEM培养基维持24h后收取上清。本发明成功制备高致病性H5N8亚型禽流感假病毒，为未来的疫苗开发和中和抗体筛选提供了重要的实验平台。

技术研发人员：何军,高勇,李卫东,王玮,俞俊岭,胡敏昊,夏艺丹
受保护的技术使用者：安徽省疾病预防控制中心（省健康教育所、省公共卫生研究院）
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24