一种使用专属性肽段组鉴定金枪鱼种属的方法及其应用与流程

本发明属于生物，涉及一组通过单独使用或任意组合使用鉴别金枪鱼种属的特征多肽及其方法、应用，尤其是一组通过单独使用或任意组合使用鉴别金枪鱼中鲣鱼和黄鳍金枪鱼的特征多肽及其方法、应用。

背景技术：

1、金枪鱼(学名：thunnini)是全球公认的一种具有高营养价值和商业价值的优质海洋鱼类。其肉质柔嫩鲜美、具有高蛋白低脂肪的特性，所含脂肪酸大多为不饱和脂肪酸，所含氨基酸齐全且氨基酸的组合优越，此外还含丰富的维生素和多种矿物质。虽然金枪鱼的年产量很大，其特殊的大型洄游生存特性以及野生生物资源的严重衰竭导致金枪鱼的价格一直居高不下。从商业角度来看，鲣鱼和黄鳍金枪鱼是印度洋热带金枪鱼渔业的目标品种，分别占金枪鱼总捕获量的51％、26％。在国际市场上，鲣鱼和黄鳍金枪鱼也是贸易最广泛的金枪鱼品种，具有很高的商业价值。

2、不同物种的金枪鱼在口感和营养价值上存在差异，价格也差异悬殊。不同物种的金枪鱼具有表观相似性，加上金枪鱼不同物种混合捕捞的作业方式，很容易造成错误的识别。此外，商品化的金枪鱼通常以加工后的形式销售，在加工过程中形态学特征会不可避免的弱化或消除，增加了金枪鱼物种鉴别的难度。在分拣、运输、包装、批发、零售的任何一个供应链环节，由于业务人员专业水平缺乏以及鉴别程序不规范，都存在着贴错标签的可能性。此外，商品化的金枪鱼缺乏规范的命名体系，尤其是不同物种的金枪鱼通常都以“tuna”命名，导致市场更为混乱。某些为了谋求更大的商业利润，以低价值的金枪鱼品种替代高价值的金枪鱼品种，以次充好。基于上述情况，目前尚无可靠先进的金枪鱼种属鉴别的解决方案，也缺乏金枪鱼产品的标准体系来监管市场。悬殊的价格差异、金枪鱼产品本身的特点以及管理体系的不完善导致金枪鱼产品的质量品质控制存在隐患，从而对金枪鱼产业的健康发展产生不利影响。为了控制金枪鱼产品的质量品质、防止经济利益驱动的掺假，必须在国家层面建立一个全面和透明的可追溯系统，确保金枪鱼产品“从海洋到餐桌”的可追溯性。因此，开发可靠有效的金枪鱼种属鉴别方法对于保护消费者利益、维护市场秩序以及推动金枪鱼产业的健康发展有着重大而深远的现实意义。

3、目前，金枪鱼种属的鉴别方法主要是基于dna的pcr技术和蛋白质的电泳技术，其中，pcr技术以dna检测为主，操作步骤繁琐，耗时，费力且昂贵，且经过加工的金枪鱼制品中的dna容易遭到破坏，导致假阴性；在金枪鱼加工过程中易导致蛋白质不稳定，会导致蛋白电泳技术或酶联免疫技术出现假阴性结果。

4、因此，亟需一种高效准确的鉴别金枪鱼种属的方法。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种使用专属性肽段组鉴别金枪鱼种属的方法，用于解决现有技术中金枪鱼种属鉴别耗时，费力、昂贵以及受蛋白稳定性以及加工技术导致鉴定结果不准确的问题，本发明提出采用特征多肽的方法鉴别金枪鱼种属，不受蛋白稳定性和深加工技术的影响，是一种高效准确的鉴定金枪鱼种属的方法。

2、本发明对金枪鱼家族中的鲣鱼和黄鳍金枪鱼的肽段进行了研究，建立了从多肽水平对金枪鱼进行种属鉴别的技术，填补了金枪鱼种属鉴别的空白。

3、本发明提供了一组通过单独使用或任意组合使用鉴别金枪鱼种属的特征多肽，其特征在于，所述特征多肽为金枪鱼蛋白的低同源性多肽片段，所述低同源性多肽片段指该肽段为鲣鱼和黄鳍金枪鱼各自独有的，且长度在17～23个氨基酸的多肽片段，所述金枪鱼蛋白选自金枪鱼中的如下蛋白：肌红蛋白和肌球蛋白轻链3；

4、所述的特征多肽的序列为：

5、seq id no.1：agitgdiagnaavaahgatvlk；

6、seq id no.2：nnfklitealahvlhek；

7、seq id no.3：evdtyqkgtyddyveglr；

8、seq id no.4：cwgpveadyttmgglvltr；

9、seq id no.5：agiaqadiagnaaisahgatvlk；

10、所述鉴别金枪鱼种属为区分鲣鱼和黄鳍金枪鱼。

11、优选的，鉴别鲣鱼的特征多肽来源于肌红蛋白和肌球蛋白轻链3，其序列为seq idno.1～3；鉴别黄鳍金枪鱼的特征多肽来源于肌红蛋白，其序列为seq id no.4～5。

12、本技术中的所述任意组合为利用seq id no.1～5所示的特征多肽的任意2种、3种、4种或全部5种多肽进行组合。

13、优选的，所述的seq id no.1～5的多肽片段的质谱法检测的质荷比(m/z)数据：

14、seq id no.1所示特征多肽的质荷比为989.54，提取离子流色谱图的传输离子对为989.54/867.50、989.54/725.43、989.54/588.37；

15、seq id no.2所示特征多肽的质荷比为989.05，提取离子流色谱图的传输离子对为989.05/833.46、989.05/762.43、989.05/625.37；

16、seq id no.3所示特征多肽的质荷比为1076.00，提取离子流色谱图的传输离子对为1076.00/966.45、1076.00/573.34、1076.00/474.27；

17、seq id no.4所示特征多肽的质荷比为1063.51，提取离子流色谱图的传输离子对为1063.51/715.45、1063.51/658.42、1063.51/488.32；

18、seq id no.5所示特征多肽的质荷比为1060.58，提取离子流色谱图的传输离子对为1060.58/883.50、1060.58/725.43、1060.58/588.37。

19、本发明还提供了一种使用专属性肽段组鉴定金枪鱼种属的方法，所述方法包括如下步骤：

20、步骤1、对待测样本进行质谱前处理，获得待测多肽滤液；

21、步骤2、通过液相色谱-质谱联用法检验多肽滤液中的多肽成分，分析待测样本的提取离子流色谱图的传输离子对结果，对比seq id no.1～5所述特征多肽的提取离子流色谱图的传输离子对，当结果中出现任一所述金枪鱼种属的特征多肽的传输离子对时，即可判断该待测样本为该特征多肽相应种属金枪鱼样本或含有相应种属金枪鱼蛋白。

22、优选的，步骤2中，所述特征多肽为seq id no.1～5中任一所示的特征多肽，其中：

23、当所述提取离子流色谱图的传输离子对结果中出现与seq id no.1～3所示特征多肽的传输离子对时，则判断待测样本为鲣鱼或含有鲣鱼蛋白；

24、当所述传输离子对结果出现与seq id no.4～5所示特征多肽的传输离子对时，则判断待测样本为黄鳍金枪鱼或含有黄鳍金枪鱼蛋白。

25、优选的，步骤1中所述的待测样本进行质谱前处理包括如下步骤：

26、(1)称取均质成粉末状态的金枪鱼样品，加入蛋白提取液提取蛋白，高速低温离心，取上清液转移到离心管中备用；

27、(2)移取蛋白上清液于超滤离心管的膜上层，加入dtt震荡混匀后37℃的水浴锅中反应1h，得中间反应液；

28、(3)取现配的碘乙酰胺溶液，加入到冷却至室温的中间反应液中，室温避光反应1h；

29、(4)采用10k da的超滤离心管超滤离心，多次使用碳酸氢铵溶液冲洗滤膜上蛋白，每次洗涤之后都需要进行超滤离心；

30、(5)在滤膜上层加入碳酸氢铵溶液配成蛋白溶液，在蛋白溶液中加入测序级胰蛋白酶，混匀后在37℃水浴中反应18小时；

31、(6)采用10k超滤膜离心超滤收集下层肽段滤液，待上机检测。

32、优选的，步骤(5)中胰蛋白酶与蛋白溶液中底物的质量比为1:50。

33、优选的，所述液相色谱-质谱联用法中的质谱检测采用三重四级杆质谱仪的多反应监测模式进行检测；

34、液相条件为：

35、色谱柱：advancebio peptide map c18色谱柱(150mm×2.1mm，2.7μm)；

36、色谱柱温度：40℃；

37、流动相a：0.1％甲酸-乙腈，流动相b：0.1％甲酸-水；

38、流动相流速：0.35ml/min；

39、流动相梯度洗脱：0～0.5min,95％ b；0.5～17min,95～65％b；17～17.5min,65～5％ b；17.5～20min,5％ b；20～20.1min,5～95％ b；20.1～25min,95％ b；

40、质谱条件如下：

41、离子化模式：esi+；

42、喷雾电压：5500v；

43、雾化气gs1：60psi；

44、辅助加热器gs2：50psi，

45、气帘气压：35psi；

46、离子源温度：575℃；

47、碰撞室入口电压：10v；

48、碰撞室出口电压：10v。

49、本发明还涉及使用所述的特征多肽在制备用于鉴别金枪鱼种属的试剂或试剂盒中的应用。

50、本发明还涉及一种用于鉴别金枪鱼种属的试剂或试剂盒，其特征在于，所述的试剂或试剂盒中包含有权利要求1～3中任一所述的特征多肽。

51、本发明通过对鲣鱼和黄鳍金枪鱼的肽段进行了研究，进行液相色谱-质谱联用检测分析，建立了从多肽水平对金枪鱼进行种属鉴别的技术；多次实验结果表明，seq idno.1～3的特征肽段序列为鲣鱼的蛋白中独有的，seq id no.4～5的特征肽段序列为黄鳍金枪鱼的蛋白中独有的，其它种属的金枪鱼蛋白中不会存在其中的任意1条及以上的特征肽段。因此，本发明得到了鉴别鲣鱼和黄鳍金枪鱼的专属性肽段组，解决了以往鲣鱼和黄鳍金枪鱼难以鉴别的问题，而且整个鉴定过程操作简单，快速，且检测不受蛋白稳定性和深加工技术的影响，保证了检测的准确性。