一种人血管性血友病因子的层析纯化方法与流程

本发明属于生物医药，具体涉及一种人血管性血友病因子的层析纯化方法。

背景技术：

1、人血管性血友病因子(vwf)是一种重要的血浆蛋白，由血管内皮细胞和血小板合成。它参与了凝血过程，起到了粘附血小板并促进凝血酶生成的作用。vwf在血管受损时被激活，与血小板表面的糖蛋白gpⅰb受体结合，使血小板粘附于受损的血管内皮细胞表面。同时，vwf还可以作为纤维蛋白原的受体，参与凝血酶的生成。

2、vwf在血友病血管性血友病因子缺乏症(vwd)中发挥重要作用。vwd是一种遗传性疾病，患者血液中vwf的浓度或功能异常，导致凝血功能障碍。根据vwf缺乏程度和症状的严重性，vwd可分为三种类型：轻度、中度和重度。轻度vwd患者可能只有轻微的关节疼痛或皮肤瘀点，而重度vwd患者可能会出现自发性出血、关节畸形和组织损伤。针对vwd的治疗方法包括输注vwf。

3、vwf的纯度会影响其药效和稳定性等性质，因此，有必要制备高纯度的vwf。制备高纯vwf的方法主要包括柱层析等。然而，现有方法制备高纯度vwf的效果仍然不够理想。这是由于，血浆中的其他蛋白质可能会干扰vwf的纯度，因此其分离较为困难。此外，由于vwf的生物活性对温度、ph值和离子强度等条件非常敏感，因此需要严格控制这些条件以确保vwf的活性和稳定性。

4、总之，如何优化vwf纯化过程中的各种工艺条件，是制备得到高纯度vwf的关键。

技术实现思路

1、针对现有技术的问题，本发明提供一种人血管性血友病因子的层析纯化方法。

2、一种人血管性血友病因子的层析纯化方法，包括如下步骤：

3、步骤1，将冷沉淀加入tris缓冲液，得到冷沉淀溶解液；

4、步骤2，向冷沉淀溶解液中加入氢氧化铝粉末，进行吸附；

5、步骤3，加入聚乙二醇，搅拌，分离上清液；

6、步骤4，使用s/d病毒灭活剂进行病毒灭活；

7、步骤5，通过阴离子交换层析进行纯化，得到含有人血管性血友病因子的洗脱液；

8、其中，所述阴离子交换层析介质为fractogel emd tmae凝胶。

9、优选的，步骤1中，所述冷沉淀和tris缓冲液的重量体积比为1:(2.5-3.5)；所述tris缓冲液浓度为15-25mm，ph为6.7-6.9。

10、优选的，步骤2中，所述氢氧化铝粉末的用量为3-5％w/w；所述吸附的温度为20-35℃，时间为10～20min。

11、优选的，步骤3中，所述聚乙二醇的终浓度为3.0～4.0％w/v；加入所述聚乙二醇后，调节ph至6.0～6.5；搅拌的时间为15～60min；所述分离的步骤包括：离心10～30min，上清液经过0.45um滤芯过滤，即得。

12、优选的，步骤4中，灭活的时间为6小时。

13、优选的，步骤5中，所述fractogel emd tmae凝胶为m型凝胶。

14、优选的，步骤5中，所述阴离子交换层析所使用的层析缓冲液系统为tris缓冲液系统。

15、优选的，步骤5中，所述阴离子交换层析的平衡缓冲液是包括如下终浓度的组分的水溶液：

16、nacl 0.6-1.5mol/l、

17、枸橼酸钠0.005-0.05mol/l、

18、甘氨酸0.05-0.2mol/l、

19、氯化钙0.0001-0.002mol/l、

20、盐酸赖氨酸0.005-0.05mol/l。

21、优选的，步骤5中，所述阴离子交换层析的洗脱缓冲液是包括如下终浓度的组分的水溶液：

22、nacl 0.1-1mol/l、

23、枸橼酸钠0.005-0.05mol/l、

24、甘氨酸0.05-0.2mol/l、

25、氯化钙0.0001-0.002mol/l、

26、盐酸赖氨酸0.005-0.05mol/l。

27、优选的，步骤5中，所述阴离子交换层析的洗脱方式为0％-50％梯度洗脱。

28、本发明还提供按照上述纯化方法制备得到的人血管性血友病因子。

29、本发明中，所述“预纯化”方法是指对vwf进行纯化的其中一个流程，目的是尽可能去除杂蛋白、大分子物质和脂类物质。

30、本发明针对vwf的层析纯化方法，进行了方法流程和工艺参数的优化。按照本发明的方法进行纯化，可有效去除血浆中的igm、fn、fib和凝血因子fii、vii、ix、x，以较高的收率制备得到高纯度的vwf。此外本发明操作简便，成本低，质量可控，具有很好的应用前景。

31、显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

32、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

技术特征：

1.一种人血管性血友病因子的层析纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.按照权利要求1中所述的纯化方法，其特征在于：步骤1中，所述冷沉淀和tris缓冲液的重量体积比为1:(2.5-3.5)；所述tris缓冲液浓度为15-25mm，ph为6.7-6.9。

3.按照权利要求1中所述的纯化方法，其特征在于：步骤2中，所述氢氧化铝粉末的用量为3-5％w/w；所述吸附的温度为20-35℃，时间为10～20min。

4.按照权利要求1中所述的纯化方法，其特征在于：步骤3中，所述聚乙二醇的终浓度为3.0～4.0％w/v；加入所述聚乙二醇后，调节ph至6.0～6.5；搅拌的时间为15～60min；所述分离的步骤包括：离心10～30min，上清液经过0.45um滤芯过滤，即得。

5.按照权利要求1中所述的纯化方法，其特征在于：步骤4中，灭活的时间为6小时。

6.按照权利要求1中所述的纯化方法，其特征在于：步骤5中，所述阴离子交换层析所使用的层析缓冲液系统为tris缓冲液系统。

7.按照权利要求1中所述的纯化方法，其特征在于：步骤5中，所述阴离子交换层析的平衡缓冲液是包括如下终浓度的组分的水溶液：

8.按照权利要求1中所述的纯化方法，其特征在于：步骤5中，所述阴离子交换层析的洗脱缓冲液是包括如下终浓度的组分的水溶液：

9.按照权利要求1中所述的纯化方法，其特征在于：步骤5中，所述阴离子交换层析的洗脱方式为0％-50％梯度洗脱。

10.按照权利要求1-9任一项所述的纯化方法制备得到的人血管性血友病因子。

技术总结
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种人血管性血友病因子的层析纯化方法。本发明方法包括如下步骤：步骤1，将冷沉淀加入Tris缓冲液，得到冷沉淀溶解液；步骤2，向冷沉淀溶解液中加入氢氧化铝粉末，进行吸附；步骤3，加入聚乙二醇，搅拌，分离上清液；步骤4，使用S/D病毒灭活剂进行病毒灭活；步骤5，通过阴离子交换层析进行纯化，得到含有人血管性血友病因子的洗脱液。本发明方法具有很好的纯化效果，且具有安全、操作简便、成本低等优势，本发明显著优于现有的vWF的纯化方式，具有良好的工业应用前景。

技术研发人员：王焰,余伟,李伟,洪树青,陈川,黄琰,余鼎,梁洪,牟蕾
受保护的技术使用者：成都蓉生药业有限责任公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24