一种菌体的洗涤方法与流程

本发明属于发酵工程领域，涉及一种菌体的洗涤方法。

背景技术：

1、蛋白质、质粒等产品生产通常通过微生物发酵的方式进行。发酵过程中，待目的产物富集到理想的产量后，停止发酵，进行菌体收集。常用的菌体收集方式分为2种，一种为离心收集，这种方法操作简单，能快速实现菌泥和培养液的分离，但该方法在放大工艺中设备受到挑战；另外一种为使用中空纤维柱进行菌体收集，通过切向流过滤技术，培养基通过透过端透过，菌泥通过回流端返回收集器中，通过不断浓缩，实现菌体收集。菌体收集后，进行菌体裂解，释放产物。

2、受发酵培养基、代谢产物、裂解死亡菌体等的干扰，若菌体收集后直接进行裂解会影响目的产物的纯度或裂解效率，进而影响质量及产量。为了避免这些干扰，需要进行菌体清洗。选择合适的清洗溶液，可以通过重悬再离心的方式进行菌体清洗，也可以通过中空纤维柱的方式不断进行洗滤换液，进行菌体清洗。菌体裂解通常采用碱裂解的方式进行，菌体重悬使用溶液i（solution i，也称为si溶液），其主要成分是葡萄糖（增大密度使细胞悬浮），edta（螯合二价金属离子ca2+、mg2+，降低dnase活性，防止dna被降解），tris-hcl（调节ph），进行菌体清洗时常使用si溶液。

技术实现思路

1、本发明公开了一种菌体的洗涤方法，该方法包括：在使用切向流过滤对含有菌体的菌液进行浓缩的过程中，使用氯化钠溶液进行菌体洗涤；所述氯化钠溶液的浓度为0.8-1%，优选为0.9%（m/v）。

2、在一些具体实施方式中，所述切向流过滤在中空纤维柱中进行。

3、在一些具体实施方式中，所述中空纤维柱的截留分子量为750-2500 kd。

4、在一些具体实施方式中，所述中空纤维柱的孔径为0.8-1 mm。

5、在一些具体实施方式中，所述切向流过滤条件包括：跨膜压（tmp）为0.4-0.9 bar。

6、在一些具体实施方式中，所述切向流过滤的条件包括：剪切速率(shear)为5000-9000 s-1。

7、在一些具体实施方式中，所述切向流过滤的条件包括：通量为12-30 l/m2/h。

8、在一些具体实施方式中，所述切向流过滤的条件包括：浓缩倍数为1-10倍。优选地，高密度发酵浓缩1-2倍，低密度发酵浓缩1-10倍。

9、在一些具体实施方式中，所述切向流过滤的条件包括：膜恢复率≥80%。

10、在一些具体实施方式中，所述氯化钠溶液的用量为所述菌液的0.5倍体积以上，优选1-10倍体积，更优选1-5倍体积。

11、在一些具体实施方式中，该方法还包括：在使用氯化钠溶液进行菌体洗涤后，进一步使用第一盐溶液进行菌体洗涤；其中，所述第一盐溶液含有：45-55 mm的葡萄糖、20-30mm的tris-cl和15-25 mm的edta，且所述第一盐溶液的ph为7.8-8.2。

12、在一些具体实施方式中，所述第一盐溶液含有：50 mm的葡萄糖、25 mm的tris-cl和10 mm edta，且所述第一盐溶液的ph为8.0。

13、在一些具体实施方式中，所述第一盐溶液的用量为所述菌液的0.5倍体积以上，优选1-10倍体积，更优选1-5倍体积。

14、在一些具体实施方式中，所述使用氯化钠溶液进行菌体洗涤的步骤，和/或所述使用第一盐溶液进行菌体洗涤的步骤，在所述浓缩的过程中通过连续导入溶液进行。

15、在一些具体实施方式中，所述氯化钠溶液和/或所述第一盐溶液的导入速度为300-700 ml/min，优选为400-500 ml/min。

16、在一些具体实施方式中，所述菌液中含有10-50wt%、优选30-50wt%的菌体。

17、在一些具体实施方式中，所述菌体为大肠杆菌。

18、发明的有益效果

19、本发明的方法在利用切向流过滤对菌体进行浓缩的过程中，选用适当的洗涤液进行菌体洗涤，从而能够大幅度提高由洗涤所得菌体提取得到的质粒的质量和产率，尤其是超螺旋比例和超螺旋质粒产量。

20、此外，本发明的洗涤方法利用切向流过滤进行连续洗涤，操作简便，洗涤效率高，洗涤过程方便可控，适用于大规模生产的需求。

技术特征：

1.一种菌体的洗涤方法，其特征在于，该方法包括：在使用切向流过滤对含有菌体的菌液进行浓缩的过程中，使用氯化钠溶液进行菌体洗涤，然后使用第一盐溶液进行菌体洗涤；

2. 根据权利要求1所述的洗涤方法，其中，所述切向流过滤的条件包括：跨膜压为0.4-0.9 bar，剪切速率为5000-9000 s-1；通量为12-30 l/m2/h，浓缩倍数为1-10倍。

3.根据权利要求1所述的洗涤方法，其中，所述氯化钠溶液的用量为所述菌液的1-5倍体积。

4.根据权利要求1所述的洗涤方法，其中，所述第一盐溶液的用量为所述菌液的1-5倍体积。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的洗涤方法，其中，所述使用氯化钠溶液进行菌体洗涤的步骤，和/或所述使用第一盐溶液进行菌体洗涤的步骤，在所述浓缩的过程中通过连续导入溶液进行。

6. 根据权利要求5所述的洗涤方法，其中，所述氯化钠溶液和/或所述第一盐溶液的导入速度为300-700 ml/min。

7. 根据权利要求6所述的洗涤方法，其中，所述氯化钠溶液和/或所述第一盐溶液的导入速度为400-500 ml/min。

8.根据权利要求1-4中任一项所述的洗涤方法，其中，所述菌液中含有30-50wt%的菌体。

9.根据权利要求1-4中任一项所述的洗涤方法，其中，所述菌体为大肠杆菌。

10.根据权利要求9所述的洗涤方法，其中，所述菌体含有质粒。

技术总结
本发明公开了一种菌体的洗涤方法，该方法包括：在使用切向流过滤对含有菌体的菌液进行浓缩的过程中，使用氯化钠溶液进行菌体洗涤。通过本发明的方法进行洗涤，可以提高由洗涤所得菌体中提取的质粒质量。

技术研发人员：鲁薪安,田海霞,何霆,亓晓温,杨路影
受保护的技术使用者：北京艺妙神州医药科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/25