一种检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的引物和探针组合及其应用的制作方法

本发明属于生物，涉及一种检测玉米夜蛾hznv-1病毒的引物和探针组合及其应用。

背景技术：

1、新兴的抗体发现技术加速了抗体的开发，会将更多的抗体候选物领向临床开发，未来全球抗体治疗产业及其市场将大幅扩大。大部分生物药（如单克隆抗体）以注射方式应用于疾病治疗，这些生物药的质量与患者的用药安全密切相关。各国监管机构出台了一系列法规来确保生物药的生物安全性，如法规中明确要求对生产用种子库细胞，对细胞培养结束时混悬液，动物组织原材料匀浆做病毒检测，即采用各种适宜的方法检测污染的病毒。

2、目前很多重组蛋白类生物制品以昆虫细胞系作为表达宿主。这些昆虫细胞主要包括了鳞翅目（lepidoptera）的sf和tn细胞系，双翅目（diptera）的s2细胞系等。另外，bombyxmori（bm）以及一些来自其他鳞翅目物种的细胞系也被偶尔使用。其中一个细胞系hz-am1，其来源于 helicothis zea （hz）也被用于重组蛋白类生物制品的开发及生产。研究表明，一种名为hznv-1病毒除了可以在hz-am1细胞中建立感染，还可以在iplb-ld652（lymantria dispar）， iplb-hz-1075 （helicoverpa zea）， iplb-sf-21 （spodopterafrugiperda）和 tn368 （tricoplusia ni） 等昆虫细胞中建立持续感染。此外，叙利亚幼地鼠肾细胞（bhk）也可被hznv-1病毒感染。这说明了哺乳动物也存在着被hznv-1病毒感染的风险。因此，生物安全检测机构需要开发一种方便、快捷、灵敏、特异性强的检测hznv-1病毒的方法。

3、目前，指导原则中推荐的用于生物安全检测的病毒检测方法包含了体外法，体内法，动物抗体产生试验，电镜，elisa，pcr，rt检测等。其中，体外法采用敏感细胞系进行共培养检测，在适宜的培养时间点（通常为28天）取样检测感染性病毒。在没有可靠的体外试验方法时，可采用适宜动物进行接种盲传试验，采用体内法检测有无感染性病毒。对于尚没有合适的体内和体外病毒检测方法时，可采用不同的动物，观察种特异病毒的抗体产生情况。以上方法由于检测周期较长，实验操作繁琐，实验动物伦理等原因，在一定程度上限制了其应用范围。核酸检测技术检测周期短，操作便利，无需动物，因此适用范围较广，且灵敏度较高，检测周期短，是hznv-1病毒检测的一种较好的选择。

4、聚合酶链式反应（pcr）是检测目标核酸片断的有力工具，pcr通过热循环驱动扩增。从1981年发明该技术以来，多种改进程序被引入以满足分子生物学领域的科研需求。定量pcr（qpcr, q-pcr）被广泛用于细胞中核酸的定量以及检测目标蛋白的表达水平。该技术已被开发应用于病毒检测以及病毒清除研究。qpcr主要的方法学是通过实时监测荧光强度来检测pcr产物的含量。而在常规pcr中，扩增产物通过电泳进行分离和可视化。qpcr中使用的dna聚合酶具有5’至3’的核酸内切酶活性，通过水解标记有荧光素和淬灭染料的寡核苷酸探针，产生荧光信号。将qpcr和荧光素标记探针相结合，理论上可以检测单个病毒dna/rna，在实际应用中qpcr可以检测到样品中个位数的病毒dna/rna，无论病毒的活性如何。目前，将qpcr用于外源性因子检测的例子是进行外源病毒因子检测，例如检测一些用于生产生物制品的工程细胞系的主细胞库（mbc），工作细胞库（wbc）是否存在特定的病毒。中国药典规定，针对人源细胞系，应考虑检测人eb病毒，人巨细胞病毒（hcmv），人逆转录（hiv-1/2，htlv1/2，人肝炎病毒（hav，hbv，hcv），人细小病毒b19，人乳头瘤病毒，人多瘤病毒，难培养的人腺病毒和人疱疹病毒-6/7/8等。另外，2020版中国药典增加了pcr（qpcr）检查方法，为荧光定量技术在病毒检测和生物制品安全评价的应用提供了法规依据。

5、因此，亟需提供一种具有良好专一性、高灵敏性的检测玉米夜蛾hznv-1病毒的引物和探针组合。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明的目的在于提供一种检测玉米夜蛾hznv-1病毒的引物和探针组合及其应用。本发明针对玉米夜蛾hznv-1病毒，设计对应的正反向引物、探针以及反应程序，建立一种具有良好专一性、高灵敏性等优点的实时定量pcr法，且该检测方法适用于生物制品大批量生产的繁复检测。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种检测玉米夜蛾hznv-1病毒的引物和探针组合，所述引物和探针组合包括检测玉米夜蛾hznv-1病毒pag1基因的引物和探针组合；

4、所述引物和探针组合包括：正向引物、反向引物和探针；

5、所述正向引物的核苷酸序列包括如seq id no:1所示的序列，所述反向引物的核苷酸序列包括如seq id no:2所示的序列；

6、所述探针的核苷酸序列包括如seq id no:3所示的序列；

7、seq id no:1：gaggttcaatgcaatccggc；

8、seq id no:2：tctgaccaacggtagcgaac；

9、seq id no:3：fam-cgaaacggccgtgcacaccgatgacg-bhq1。

10、本发明中，通过对ncbi数据库中hznv-1所有分离株（包括accession: nc_074969.1和accession: af451898.1）共2条完整的hznv-1基因序列（全基因组碱基数为228089bp）做同源性比对，设计出1组实时定量pcr的正反向引物以及探针，所述引物和探针组合能够高效、准确地检测出所有类型的hznv dna，并且不受大量背景细胞dna的影响，特别适用于检测生物制药原料和产品，尤其是细胞库中的hznv-1病毒污染。

11、优选地，所述探针的5’端含有荧光基团，3’端含有淬灭基团。

12、优选地，所述荧光基团包括fam、vic或hex中任意一种或至少两种的组合。

13、优选地，所述淬灭基团包括mgb、bhq1或tamra中任意一种或至少两种的组合。

14、优选地，所述正向引物和反向引物扩增的目的片段的序列包括如seq id no:4所示的序列；

15、seq id no:4：

16、ctcaacgaaaagtatccattcttggcgtcgcacttgaaagtcaacgtcagagcggccaccgatgccgattattacattccaccggcaatggcctccgaggccatattcgtagaggcagagattacaaaacaattgtgcgagagcatttcgtgcaactcgtccggtgtgcacggaccctgcaaaaagacggatgcggccagctactatagattgggcgagagtgaaaactttgaggttcaatgcaatccggcctgcttccacttgttcgaaacggccgtgcacaccgatgacggtaccgacaagccacacaacgttcgctaccgttggtcagagactagcaacacttgcaatatcgtaccttttgcagccacctggatggagattccccggtatcggtccagtgaactgtacgcgcctaggctaaacgatctcgacaccggctttgactatgagccgtccacggacacgtatcactttaacaaatactattgcgacgttta。

17、第二方面，本发明提供一种检玉米夜蛾hznv-1病毒的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的检测玉米夜蛾hznv-1病毒的引物和探针组合。

18、优选地，所述试剂盒还包括病毒核酸标准品和荧光定量pcr反应试剂。

19、优选地，所述病毒核酸标准品包括目的片段的dna片段，所述目的片段的dna片段的序列包括如seq id no:4所示的序列。

20、优选地，所述荧光定量pcr反应试剂包括酶液和反应缓冲液，所述酶液包括dna聚合酶。

21、第三方面，本发明提供一种以非疾病诊断和/或治疗为目的的检测玉米夜蛾hznv-1病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

22、（1）采集并处理待测样品，配制荧光定量pcr体系；

23、（2）对待测样品和病毒核酸标准品进行荧光定量pcr反应，得到待测样品和病毒核酸标准品的荧光信号，对荧光信号进行数据处理，得到ct值及扩增曲线，所述荧光定量pcr反应的反应体系包括第一方面所述的检测玉米夜蛾hznv-1病毒的引物和探针组合；

24、（3）根据病毒核酸标准品的浓度和ct值，绘制荧光定量标准曲线，根据荧光定量标准曲线对待测样品进行定性和定量检测。

25、优选地，所述荧光定量pcr体系按终浓度计包括：1×的taqman universal pcrmaster mix、800-900 nm的正向引物、800-900 nm的反向引物和220-250 nm的探针；

26、所述荧光定量pcr反应的程序包括：步骤1：94-96℃，8-12 min；步骤2：94-96℃，13-17 sec；步骤3：58-62℃，0.8-1.2 min；步骤2和步骤3，40-42个循环。

27、上述800-900 nm中的具体点值可以选择800 nm、820 nm、840 nm、860 nm或900 nm等。

28、上述220-250 nm中的具体点值可以选择220 nm、230nm、240 nm、245 nm或250 nm等。

29、上述94-96℃中的具体点值可以选择94℃、95℃或96℃等。

30、上述8-12 min中的具体点值可以选择8 min、9 min、10 min、11 min或12 min等。

31、上述13-17 sec中的具体点值可以选择13 sec、14 sec、16 sec或17 sec等。

32、上述58-62℃中的具体点值可以选择58℃、59℃、60℃、61℃或62℃等。

33、上述0.8-1.2 min中的具体点值可以选择0.8 min、0.9 min、1.0 min、1.1 min或1.2 min等。

34、上述40-42个循环中的具体点值可以选择40个循环、41个循环或42个循环等。

35、第四方面，本发明提供一种检测玉米夜蛾hznv-1病毒的系统，所述系统包括样品制备模块、检测模块和分析模块；

36、所述样品制备模块用于执行包括：

37、采集并处理待测样品，配制荧光定量pcr体系，所述pcr体系包括第一方面所述的检测玉米夜蛾hznv-1病毒的引物和探针组合；

38、所述荧光定量pcr体系按终浓度计包括：1×的taqman universal pcr mastermix、800-900 nm的正向引物、800-900 nm的反向引物和220-250 nm的探针；

39、所述荧光定量pcr反应的程序包括：步骤1：94-96℃，8-12 min；步骤2：94-96℃，13-17 sec；步骤3：58-62℃，0.8-1.2 min；步骤2和步骤3，40-42个循环；

40、所述检测模块用于执行包括：

41、对荧光定量pcr体系进行荧光定量pcr反应；

42、所述分析模块用于执行包括：根据荧光定量标准曲线，对待测样品进行定性和定量检测。

43、第五方面，本发明提供第一方面所述的检测玉米夜蛾hznv-1病毒的引物和探针组合、第二方面所述的检测玉米夜蛾hznv-1病毒的试剂盒或第四方面所述的检测玉米夜蛾hznv-1病毒的系统中的任意一种或至少两种的组合在制备检测玉米夜蛾hznv-1病毒的产品中的应用。

44、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

45、（1）本发明通过对ncbi数据库中hznv-1所有分离株（包括accession: nc_074969.1和accession: af451898.1）共2条完整的hznv-1基因序列（全基因组碱基数为228089bp）做同源性比对，设计出1组实时定量pcr的正反向引物以及探针，本发明的检测方法能够检测出ncbi数据库中现有的所有hznv-1病毒分离株（包括accession: nc_074969.1和accession: af451898.1），本发明选择的扩增检测区域是hznv-1基因组中非常保守的区域，对于将来新出现的变异株被本发明所述方法检测到的几率很高；

46、（2）本发明的检测方法用时2.0 h，与病毒细胞培养检测相比，时间缩短较大，降低了人工和物料成本；

47、（3）本发明的检测方法可以检测出hznv-1（包括accession: nc_074969.1和accession: af451898.1）低至10个病毒基因组拷贝，该方法的高灵敏度和高覆盖率能够更好地保证生物制品的安全性；

48、（4）细胞库的生物安全检测需要检测到大量细胞中的微量病毒污染，用pcr方法做检测时，检测样本dna中也包含大量的细胞dna与微量的病毒dna（如果病毒污染存在），大量的细胞dna常常会抑制pcr反应，而本发明的检测方法不会被细胞总dna所干扰，特别适合于检测含细胞的样品中的病毒污染。