一种用于生长缓慢菌株分离培养的方法与流程

本发明专利涉及微生物分离培养方法，尤其是一种用于生长缓慢菌株分离培养的方法。

背景技术：

1、微生物蕴含着丰富的发展潜力，覆盖了疾病治疗、生物能源转化、生物肥料与农药研制、食品添加剂改良、水土净化与改良、垃圾分解等各领域；这些有益的资源菌株，对于促进医药、食品、农业、环境等众多产业发展具有重要意义。

2、然而，自然界中90％以上微生物尚未实现人工培养，被称为微生物界中的“暗物质”，这极大阻碍了人类对微生物生态的认知以及微生物资源的开发利用。

3、在环境中，那些生长缓慢的菌株在群体中的丰度经常很低，有些却具有重要的生态功能，使得筛选培养面临着更大的挑战。

4、现有技术中，常采用划线培养法的方式进行筛选等操作，由于划线培养法的随机性强，生长缓慢的低丰度微生物常常会被生长速度更快的高丰度微生物掩盖，使得高精度的筛选操作无法实现。

5、现有技术中，还有一种采用微生物富集方法(即过滤法等)，这种方式只能针对低生物量样品中微生物的整体富集，难以针对生长缓慢的微生物类群进行富集和筛选；而针对功能性微生物进行筛选的选择性培养法，同样很可能由于生长速度问题而使低丰度的生长缓慢菌在筛选过程中丢失。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种用于生长缓慢菌株分离培养的方法，通过结合磁性颗粒及微生物单细胞弹射分选技术，实现对群体中生长缓慢的低丰度菌株的富集、筛选及培养，有效提高了生长缓慢微生物的分离培养效率，方法设计科学独到，适合推广。

2、为解决上述技术问题，本发明提供一种用于生长缓慢菌株分离培养的方法，包括：

3、步骤一：获取所需微生物样品；

4、作为一种举例说明，所述微生物样品包括：土壤样品、水体样品、沉积物样品、气体样品、粪便样品、尿液样品、痰液样品、血液样品以及动植物组织样品。

5、步骤二：制备磁性颗粒；

6、将fecl2溶液与fecl3溶液混合，将naoh溶液缓慢逐滴加入上述溶液中，涡旋搅拌，用磁场收集上述磁性颗粒，使用ddh2o清洗，取出磁性颗粒与丙烯胺盐酸盐混合，并经超声、离心操作，沉淀重悬于ddh2o中，涡旋混匀，使用滤器过滤待用；

7、步骤三：将所述微生物样品与所述磁性颗粒震荡混合，弃去上清，向沉淀中加入适量培养基，在适宜的条件下对样品中的微生物进行培养；在培养过程中，生长速度快的菌株随着分裂增殖逐渐失去磁性，而生长速度缓慢的菌株依然保持磁性；

8、步骤四：使用磁场对微生物样品中的微生物进行分离，收集沉淀中的微生物；

9、作为一种举例说明，所述磁场为：磁力架、磁铁或电磁场中的一种或者组合。

10、步骤五：将沉淀中的微生物用缓冲液重悬，并与用于保持细胞活性的保水物质共同平铺于分选芯片表面；即，先将半固体保水物质或固体保水物质平铺于分选芯片的表面形成保水薄层，再将微生物涂于所述保水薄层表面。

11、作为一种举例说明，所述保水物质为水凝胶保水物质。

12、作为一种举例说明，所述水凝胶保水物质，其组成成分为：0.5％-10％胶原、1％-10％聚乙二醇、0.1％-10％海藻酸盐试剂。

13、作为一种举例说明，所述保水薄层的厚度为：1-100μm。

14、步骤六：使用弹射分选方法将微生物个体逐一分选至装有适宜的培养基的接收器中，进行培养；收集到的生长缓慢微生物个体，通过后续培养长成菌株。

15、作为一种举例说明，所述弹射分选方法为：基于激光诱导向前转移技术的弹射分选。

16、作为一种举例说明，所述接收器为ep管盖、培养皿或孔板。

17、本发明的有益效果：

18、本发明使用磁性颗粒对群体中生长速度不同的菌株进行分离，获得生长速度缓慢的微生物类群，再通过弹射分选技术，将生长缓慢的微生物个体逐一分离后进行培养，从而有效提高生长缓慢微生物筛分培养的成功率及效率。

19、本发明设计方法科学巧妙，很好的解决了现有技术无法克服的技术难题，操作简便、安全，稳定。

技术特征：

1.一种用于生长缓慢菌株分离培养的方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的一种用于生长缓慢菌株分离培养的方法，其特征在于，所述微生物样品包括：土壤样品、水体样品、沉积物样品、气体样品、粪便样品、尿液样品、痰液样品、血液样品以及动植物组织样品。

3.根据权利要求1所述的一种用于生长缓慢菌株分离培养的方法，其特征在于，所述磁场为：磁力架、磁铁或电磁场中的一种或者组合。

4.根据权利要求1所述的一种用于生长缓慢菌株分离培养的方法，其特征在于，所述保水物质为水凝胶保水物质。

5.根据权利要求4所述的一种用于生长缓慢菌株分离培养的方法，其特征在于，所述水凝胶保水物质，其组成成分为：0.5％-10％胶原、1％-10％聚乙二醇、0.1％-10％海藻酸盐试剂。

6.根据权利要求1所述的一种用于生长缓慢菌株分离培养的方法，其特征在于，所述保水薄层的厚度为：1-100μm。

7.根据权利要求1所述的一种用于生长缓慢菌株分离培养的方法，其特征在于，所述弹射分选方法为：基于激光诱导向前转移技术的弹射分选。

8.根据权利要求1所述的一种用于生长缓慢菌株分离培养的方法，其特征在于，所述接收器为ep管盖、培养皿或孔板。

9.根据权利要求1所述的一种用于生长缓慢菌株分离培养的方法，其特征在于，所述制备磁性颗粒，具体操作为：1ml 1mol/l fecl2溶液与2ml 2mol/l fecl3溶液混合，将25ml2mol/l naoh溶液缓慢逐滴加入上述溶液中，涡旋搅拌30min，用磁场收集上述磁性颗粒，使用ddh2o清洗5-7次，取5ml磁性颗粒与45ml 10mg/ml丙烯胺盐酸盐混合，75w，40khz超声60min，10000g离心10min，沉淀重悬于50ml ddh2o中，涡旋混匀，使用0.2mm滤器过滤待用。

技术总结
本发明提供一种用于生长缓慢菌株分离培养的方法，包括：获取所需微生物样品；制备磁性颗粒；将所述微生物样品与所述磁性颗粒震荡混合，使用磁场对微生物样品中的微生物进行分离，收集沉淀中的微生物；将沉淀中的微生物用缓冲液重悬，并与用于保持细胞活性的保水物质共同平铺于分选芯片表面，使用弹射分选方法将微生物个体逐一分选至装有适宜的培养基的接收器中，进行培养；本发明使用磁性颗粒对群体中生长速度不同的菌株进行分离，获得生长速度缓慢的微生物类群，再通过弹射分选技术，将生长缓慢的微生物个体逐一分离后进行培养，从而有效提高生长缓慢微生物筛分培养的成功率及效率。

技术研发人员：李航,洪喜,李天宇,薛莹,梁鹏,李硕
受保护的技术使用者：海宁市高新技术研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/3/27