多倍体腺相关病毒载体及其制备和使用方法

本发明涉及与表面蛋白结合的来自腺相关病毒(aav)颗粒、病毒粒子、病毒衣壳和病毒载体的修饰的衣壳蛋白，用于增强包含其的。特别地，本发明涉及修饰的aav衣壳蛋白和包含其的衣壳，其可以掺入病毒载体内，以组合病毒载体中的转导以及减少的抗原性、向性和/或其它期望的表型特点。

背景技术：

1、腺相关病毒(aav)载体已用于100多项临床试验中，具有很有希望的结果，特别是用于治疗失明和血友病b。aav是非致病性的，具有广泛的组织向性，并且可以感染分裂细胞或非分裂细胞。更重要的是，aav载体转导已在临床前试验和临床试验中诱导长期治疗性转基因表达。目前，存在被分离用于基因递送的12种aav血清型。在其中，aav8已显示为对于小鼠肝靶向最优。由于在具有fix缺乏的临床前动物中的广泛研究，在患有血友病b的患者中已使用aav2和aav8进行了i/ii期临床试验。来自这些试验的结果是非常有希望的；然而，即使使用相同的载体剂量/kg，来自接受aav/fix的患者的fix表达也与动物模型中已实现的结果不成比例。当1x1011个编码fix的aav8颗粒用于fix敲除小鼠中用于全身施用时，在血液中检测到160％的正常水平fix。然而，当施用2x1011个aav8/fix颗粒时，在灵长类动物中仅达到40％的fix，并且在人中发现少于1％的fix。这些物种中的aav载体转导后不一致的fix表达可能是由于不同物种中改变的肝细胞向性。来自aav fix临床试验的另一个有趣发现是衣壳特异性细胞毒性t淋巴细胞(ctl)应答，其根除aav转导的肝细胞，导致治疗失败。这种现象尚未在aav递送后的动物模型中得到证实，其指出在临床前和临床研究之间的另一种变化。当使用高得多剂量的aav/fix载体时，使用aav2或aav8在两个临床试验中检测到fix表达；然而，血液fix水平分别在注射后第4周或第9周时降低。进一步的研究提示，aav载体感染引发衣壳特异性ctl应答，其看起来消除了aav转导的肝细胞。因此，来自这些临床试验的结果强调了探讨用于增强aav转导而不增加载体衣壳负荷的有效方法的必要性。减少aav衣壳抗原的任何载体改善也影响令人畏缩的载体生产关注，并且是可行的基因治疗药物开发的受欢迎的补充物。

2、腺相关病毒(aav)，需要辅助病毒用于有效复制的非致病性依赖性细小病毒，因其安全性和简单性用作用于基因治疗的病毒载体。aav具有广泛的宿主和细胞类型向性，能够转导分裂细胞和非分裂细胞两者。迄今为止，已鉴定了12种aav血清型和多于100种变体。不同血清型衣壳在组织或培养细胞中具有不同的感染性，其依赖于在细胞表面上或细胞内运输途径本身的主要受体和共受体。已确定了一些aav血清型的主要受体，例如关于aav2和aav3的硫酸肝素蛋白多糖(hspg)以及关于aav5的n联唾液酸，而aav7和aav8的主要受体尚未得到鉴定。有趣的是，培养细胞中的aav载体转导效率可能并不总是转化为动物中的那种。例如，aav8在小鼠肝中诱导比其它血清型高得多的转基因表达，但在培养细胞系中则不是。

3、在12种血清型中，几种aav血清型和变体已用于临床试验中。作为第一个表征的衣壳，aav2已被最广泛地用于基因递送中，例如用于利伯先天性黑蒙的rpe 65和用于血友病b的因子ix(fix)。尽管aav载体的应用已证明是安全的并且已在这些临床试验中实现了疗效，但aav载体的主要挑战之一是它的低感染性，其需要相对大量的病毒基因组。aav8载体是另一种载体，其已用于患有血友病b的患者中的几项临床试验中。来自aav8/fix肝靶向递送的结果已证实在小鼠、非人灵长类动物和人之间的转基因表达中存在明显的物种特异性差异。虽然1010vg具有fix基因的aav8在fix敲除小鼠中可以达到超生理水平(>100％)的fix表达，但仅高剂量(2x 1012vg/kg体重)可以在人中诱导可检测的fix表达。基于上述这些结果，仍然需要开发增强aav转导的有效策略。

4、大多数人已自然暴露于aav。结果，大部分人群已在血液及其它体液中发展针对aav的中和抗体(nab)。nab的存在对未来临床试验中更广泛的aav应用提出了另一个重大挑战。已探讨了许多方法以增强aav转导或逃避nab活性，尤其是基于合理设计和定向进化的aav衣壳的遗传修饰。尽管几种aav突变体已证实在体外或在动物模型中的高转导，连同逃避nab的能力，但衣壳组合物的修饰提供了改变亲本aav的细胞向性的能力。

5、本发明解决了本领域对于具有组合期望特点的aav载体的需要。

技术实现思路

1、在一个方面，本发明提供了包含表面结合蛋白的腺相关病毒(aav)颗粒，其中与aav颗粒的表面结合的蛋白质选自：(a)纤维蛋白原α链；(b)纤维蛋白原β链；(c)纤维蛋白原γ链；(d)纤连蛋白；(e)纤溶酶原；(f)血管性血友病因子；(g)α-1-酸性糖蛋白；(h)血小板因子4；(i)冷沉淀物；(j)因子viii；(k)因子xiii；(l)白蛋白(例如人血清白蛋白，或来自任何其它物种例如犬、马、牛、猪的白蛋白)；(m)载脂蛋白b(apob)，(n)载脂蛋白e(apoe)；(o)转铁蛋白；(p)低密度脂蛋白；(q)免疫球蛋白；(r)任何其它血清蛋白质和融合血清蛋白质，其增加在细胞表面上的aav结合和/或增强aav细胞内运输；以及(s)上述(a)-(r)的任何组合。

2、我们先前的研究已显示来自不同aav血清型(aav1至aav5)的衣壳是相容的，以组装单倍体aav衣壳，并且大多数分离的aav单克隆抗体识别位于不同aav亚基上的几个位点。另外，来自嵌合aav衣壳的研究证实，通过引入关于主要受体的结构域或来自其它血清型的组织特异性结构域，可以实现更高的转导。将aav9聚糖受体引入aav2衣壳内增强aav2转导。将来自aav6的100氨基酸(aa)结构域取代到aav2衣壳内增加了肌肉向性。我们推测由来自两种或更多种aav血清型的衣壳组成的多倍体aav载体可以利用来自个别血清型的优点用于更高转导而不消除来自亲本的向性。此外，这些多倍体病毒可能具有逃避由nab中和的能力，因为大多数nab识别构象表位并且多倍体病毒体可能已改变其表面结构。

3、aav2和aav8已用于临床应用。在这项研究中，我们首先表征来自aav2和aav8的单倍体aav病毒的体外和体内转导效率，以及nab逃避能力。我们发现单倍体载体的病毒产率没有减弱，并且肝素结合概况与aav2衣壳亚基蛋白的掺入有关。单倍体载体aav2/8在小鼠肌肉和肝中起始更高的转导。当应用于具有fix缺乏的小鼠模型时，与aav8组相比，在单倍体载体处理的小鼠中观察到更高的fix表达和改善的出血表型校正。重要的是，单倍体病毒aav2/8对a20具有低结合亲和力，并且能够逃避来自抗aav2血清的中和。下一个单倍体病毒aav2/8/9由三种血清型(aav2、8和9)的衣壳制备。已证实单倍体aav2/8/9的中和抗体逃避能力针对用亲本血清型免疫的血清得到显著改善。

4、因此，在一个实施方案中，本发明提供了腺相关病毒(aav)衣壳，其中所述衣壳包含衣壳蛋白vp1，其中所述衣壳蛋白vp1来自一种或多于一种第一aav血清型，以及衣壳蛋白vp3，其中所述衣壳蛋白vp3来自一种或多于一种第二aav血清型，并且其中所述第一aav血清型中的至少一种在任何组合中不同于所述第二aav血清型中的至少一种。

5、在一些实施方案中，本发明的衣壳包含衣壳蛋白vp2，其中所述衣壳蛋白vp2来自一种或多于一种第三aav血清型，其中所述一种或多于一种第三aav血清型中的至少一种在任何组合中不同于所述第一aav血清型和/或所述第二aav血清型。

6、在一些实施方案中，本发明的衣壳包含衣壳蛋白vp1.5，其中所述衣壳蛋白vp1.5来自一种或多于一种第四aav血清型，其中所述一种或多于一种第四aav中的至少一种血清型在任何组合中不同于所述第一aav血清型和/或所述第二aav血清型。在一些实施方案中，本文所述的aav衣壳蛋白可以包含衣壳蛋白vp2。

7、本发明还提供了aav衣壳，其中所述衣壳包含衣壳蛋白vp1，其中所述衣壳蛋白vp1来自一种或多于一种第一aav血清型，以及衣壳蛋白vp2，其中所述衣壳蛋白vp2来自一种或多于一种第二aav血清型，并且其中所述第一aav血清型中的至少一种在任何组合中不同于所述第二aav血清型中的至少一种。

8、在一些实施方案中，衣壳包含衣壳蛋白vp3，其中所述衣壳蛋白vp3来自一种或多于一种第三aav血清型，其中所述一种或多于一种第三aav血清型中的至少一种在任何组合中不同于所述第一aav血清型和/或所述第二aav血清型。在一些实施方案中，本文所述的aav衣壳可以包含衣壳蛋白vp1.5。

9、本发明进一步提供了腺相关病毒(aav)衣壳，其中所述衣壳包含衣壳蛋白vp1，其中所述衣壳蛋白vp1来自一种或多于一种第一aav血清型，以及衣壳蛋白vp1.5，其中所述衣壳蛋白vp1.5来自一种或多于一种第二aav血清型，并且其中所述第一aav血清型中的至少一种在任何组合中不同于所述第二aav血清型中的至少一种。

10、在另外的实施方案中，本发明提供了病毒载体，其包含：(a)本发明的aav衣壳；以及(b)包含至少一个末端重复序列的核酸，其中所述核酸被aav衣壳包入衣壳(encapsidated)。病毒载体可以是aav颗粒，并且本发明的衣壳蛋白、衣壳、病毒载体和/或aav颗粒可以存在于进一步包含药学上可接受的载体的组合物中。

11、本文进一步提供的是制备包含前述权利要求中任一项的aav衣壳的aav颗粒的方法，其包括：(a)用一种或多种质粒转染宿主细胞，所述质粒组合提供组装aav颗粒所需的所有功能和基因；(b)将一种或多种核酸构建体引入包装细胞系或生产细胞系内，以组合提供组装aav颗粒所需的所有功能和基因；(c)将一种或多种重组杆状病毒载体引入宿主细胞内，所述重组杆状病毒载体组合提供组装aav颗粒所需的所有功能和基因；和/或(d)将一种或多种重组疱疹病毒载体引入宿主细胞内，所述重组疱疹病毒载体组合提供组装aav颗粒所需的所有功能和基因。

12、在进一步的实施方案中，本发明提供了向细胞施用核酸的方法，该方法包括使细胞与本发明的病毒载体和/或本发明的组合物接触。

13、本文还提供的是向受试者递送核酸的方法，该方法包括向受试者施用本发明的病毒载体和/或组合物。

14、另外，本文提供的是本发明的衣壳蛋白、衣壳、病毒载体、aav颗粒和/或组合物，用作病症或疾病的有益治疗中的药剂。

15、在下文阐述的本发明的描述中更详细地解决了本发明的这些和其它方面。