针对猴痘病毒A35R蛋白的抗体及其相关产品和用途的制作方法

本发明属于检测用抗体制备领域，具体地，本发明涉及针对猴痘病毒a35r蛋白的抗体及其相关产品和用途，更具体地，本发明涉及针对猴痘病毒a35r蛋白的抗体2a7及其相关产品和用途。

背景技术：

1、猴痘病毒(mpxv)属于痘病毒科、正痘病毒属。痘病毒是所有动物病毒中构造最大且最复杂的一群病毒，种类较多，都是结构较为复杂的dna病毒。痘病毒依血清反应及形成方式分为六个亚属，正痘病毒属是痘病毒的第一亚属。在正痘病毒属家族中只有天花病毒、牛痘病毒、痘苗病毒和猴痘病毒四种可以引起人类感染，它们都含有可溶性的抗原、核蛋白抗原和红细胞凝集素，抗原性质基本相同，彼此之间有交叉免疫性。

2、由猴痘病毒引起的猴痘是一种罕见的人畜共患病。该病主要通过动物传播，人类可以因为被感染动物的咬伤或者直接接触感染动物的血液、体液和皮疹而感染猴痘。此外该病毒也可通过人与人传播，主要是通过长期的、直接的面对面接触时的呼吸道飞沫传播；另外，猴痘还可以通过直接接触猴痘病人的体液或者被污染的物品而传播。所有年龄组都可能感染此病，但没有预防接种的儿童死亡的危险性很高，约有10％的病死率。

3、猴痘病毒基本的感染形态为成熟病毒粒子(mature virion，mv)，除此之外，还有一种形态：成熟病毒粒子外还包绕有一层来源于内质网膜的脂质膜(extracellularenveloped，ev)。其中，a35r与牛痘病毒的a33r高度相似，是一种细胞外包膜病毒(eev)特异性ii型膜糖蛋白，在有效的eev形成中起着关键作用，并有助于病毒颗粒的有效细胞间传播，是开发猴痘病毒诊断性或治疗性抗体的潜在靶点。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于：为本领域提供一种针对猴痘病毒a35r蛋白的抗体。本发明涉及一种抗猴痘病毒a35r蛋白的抗体及其相关产品、方法和用途，所述抗猴痘病毒a35r蛋白的抗体为本发明的发明人经过大量的筛选制备得到的单克隆抗体2a7，所述抗体2a7能够特异性结合猴痘病毒a35r蛋白，且具有较好的结合活性，在猴痘病毒感染相关疾病的检测试剂盒开发中具有良好的应用前景，能够用于猴痘病毒感染的早期筛查和诊断中。基于此，发明人提出了本项专利申请。本发明所要解决以上技术问题采取以下技术方案得以实现：

2、本发明采用如下技术方案实现上述目的：

3、在一方面，本发明提供了一种针对猴痘病毒a35r蛋白的抗体。

4、进一步，所述抗体的重链可变区中包含三个重链互补决定区hcdr1-3，所述抗体的轻链可变区中包含三个轻链互补决定区lcdr1-3；

5、所述hcdr1-3的氨基酸序列分别如seq id no:2-4所示，所述lcdr1-3的氨基酸序列分别如seq id no:6-8所示。

6、进一步，所述抗体包含：

7、(i)如seq id no:5所示的重链可变区或与seq id no:5所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的重链可变区；

8、(ii)如seq id no:9所示的轻链可变区或与seq id no:9所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的轻链可变区。

9、在一些实施方案中，所述重链可变区还包括如seq id no:5所示的重链可变区的功能变体，所述轻链可变区还包括如seq id no:9所示的轻链可变区的功能变体，所述功能变体通过插入、缺失和/或取代其中的一个或多个氨基酸形成，前提是功能变体保留结合猴痘病毒a35r蛋白的能力。

10、所述功能变体包含或组成为与亲本多肽(如前所述本发明提供的抗体)的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同源性的氨基酸序列。

11、在功能变体的内容中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量优选不超过亲本氨基酸序列(如前所述本发明提供的抗体对应的氨基酸序列)中氨基酸总数的40％，更优选不超过35％，更优选是1％至33％，并且更优选是5％至30％，更优选是10％至25％，更优选是15％至20％。例如，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量可以是1至20，优选是1至10，更优选是1至7，还更优选是1至5，最优选是1至2。在优选的实施方案中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量是1、2、3、4、5、6或7。在一些实施方案中，所述插入、缺失和/或取代可以在框架(fr)区，例如在fr1、fr2、fr3和/或fr4进行。

12、在一些实施方案中，一个或多个氨基酸的取代可以是一个或多个氨基酸的保守取代。此类保守取代优选地是以下组(a)至(e)中的一个氨基酸被同组中的另一个氨基酸残基取代：(a)小的脂肪族、非极性或弱极性残基：ala、ser、thr、pro和gly；(b)极性、带负电的残基及其(不带电的)酰胺：asp、asn、glu和gln；(c)极性、带正电的残基：his、arg和lys；(d)大的脂肪族、非极性残基：met、leu、he、val和cys；(e)芳香族残基：phe、tyr和trp。

13、在一些实施方案中，本发明所述hcdr1-3、lcdr1-3对应的氨基酸序列并不局限于本发明具体列举出的序列，采用任何cdr编号方案(现有的cdr编号方案或将来产生的新的cdr编号方案)分别对如seq id no:5所示的重链可变区中的hcdr1-3进行定义、对如seq idno:9所示的轻链可变区中的lcdr1-3进行定义得到的hcdr1-3、lcdr1-3对应的抗体的氨基酸序列或核苷酸序列均在本发明的保护范围内。在具体实施方案中，所述cdr编号方案包括但不限于：imgt编号方案、kabat编号方案、chothia编号方案、martin(增强型chothia)编号方案、abm编号方案、aho编号方案、contact编号方案中的任意一种或任意多种(两种或两种以上)组合。

14、在另一方面，本发明提供了一种编码如前所述抗体的多核苷酸分子。

15、进一步，所述多核苷酸分子选自如下组：

16、(i)编码如前所述抗体的多核苷酸分子；

17、(ii)编码如前所述抗体的重链可变区的多核苷酸分子；

18、(iii)编码如前所述抗体的轻链可变区的多核苷酸分子。

19、在一些实施方案中，所述多核苷酸分子可通过重组dna技术制备得到。在本发明中，可以通过本领域技术人员已知的多种方法来制备编码本发明如前所述的抗体的多核苷酸分子，这些方法包括但不限于：采用限制性片段操作或采用合成性寡核苷酸的重叠延伸pcr等。

20、在又一方面，本发明提供了一种包含如前所述多核苷酸分子的表达载体；

21、优选地，所述载体包括病毒来源载体、质粒载体；

22、更优选地，所述病毒来源载体包括腺病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体。

23、在一些实施方案中，包含如前所述的多核苷酸分子的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体，在此不作限制。

24、在一些实施方案中，可用于本发明的载体的实例包括但不限于：质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体、病毒来源的载体。可选用本领域已知的各种载体，例如选用市售的载体，然后将编码上述抗体的核苷酸序列可操作性地连于表达调控序列上形成表达载体。

25、在一些实施方案中，所述病毒来源的载体包括但不限于：慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体、杆状病毒载体、乳头状瘤病毒载体、乳头多瘤空泡病毒载体。

26、在一些实施方案中，载体是表达载体，例如真核表达载体，载体的实例包括但不限于：病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(yac)等。在另一个实施方案中，所述载体包含任选的调控序列；在一些实施方案中，所述调控序列可以选自前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列、转录终止子，或其任何组合，在此不作限制。

27、在又一方面，本发明提供了一种包含如前所述表达载体的重组宿主细胞。

28、在一些实施方案中，所述宿主细胞包括酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。在一些实施方案中，合适的宿主细胞包括原核微生物，如大肠杆菌。宿主细胞还可以是真核微生物如丝状真菌或酵母，或各种真核细胞，例如昆虫细胞等。也可以将脊椎动物细胞用作宿主细胞。

29、在一些实施方案中，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括sv40转化的猴肾cv1系(cos-7)；人胚肾系(hek293或293f细胞)、293细胞、幼仓鼠肾细胞(bhk)、猴肾细胞(cv1)、非洲绿猴肾细胞(vero-76)、人宫颈癌细胞(hela)、犬肾细胞(mdck)、布法罗大鼠肝脏细胞(brl 3a)、人肺细胞(w138)、人肝脏细胞(hep g2)、中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞)、chos细胞、nso细胞、骨髓瘤细胞系如y0、ns0、p3x63和sp2/0等。适于产生蛋白质的哺乳动物宿主细胞系均在本发明的保护范围内。

30、在又一方面，本发明提供了一种制备如前所述抗体的方法。

31、进一步，所述方法包括如下步骤：

32、(i)在适合抗体产生的条件下，培养如前所述的重组宿主细胞，获得含有抗体的细胞培养物；

33、(ii)从步骤(i)获得的细胞培养物中分离或回收得到如前所述的抗体。

34、在又一方面，本发明提供了一种体外非诊断和非治疗目的地特异性抑制a35r蛋白活性的方法。

35、进一步，所述方法包括如下步骤：将如前所述的多核苷酸分子导入到生物体细胞中，通过表达如前所述的抗体抑制a35r蛋白的活性。

36、在又一方面，本发明提供了一种免疫偶联物或检测试剂或检测试剂盒。

37、进一步，所述免疫偶联物包含如期所述的抗体和与所述抗体偶联的偶联物；

38、优选地，所述偶联物包括生物发光剂、放射性核素、光敏诊断剂、顺磁性离子、化学发光剂、酶；

39、优选地，所述检测试剂包含如前所述的抗体；

40、优选地，所述检测试剂盒包含所述免疫偶联物和/或检测试剂。

41、在一些实施方案中，所述生物发光剂包括荧光素、水母发光蛋白；所述放射性核素包括120i、123i、124i、64cu、67cu、18f、52fe、62cu、13n、15o、86y、90y、89zr、125i、131i、186re；所述光敏诊断剂包括亚甲基蓝、二羟基硅酞菁、原卟啉、光卟啉；所述顺磁性离子包括铜(ii)、铁(iii)、铁(ii)、钴(ii)、镱(iii)、锰(ii)、镍(ii)、钆(iii)、钕(iii)、钐(iii)、钒(ii)；所述化学发光剂包括芳族吖啶酯、咪唑、异鲁米诺、鲁米诺、吖啶盐、草酸酯；所述酶包括脲酶、过氧化氢酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶、β-d-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶。本发明对所述偶联物并无特别限制。

42、在又一方面，本发明提供了如下任一方面应用：

43、(1)如前所述的抗体、如前所述的多核苷酸分子、如前所述的表达载体、如前所述的重组宿主细胞、如前所述的免疫偶联物、检测试剂或检测试剂盒在非诊断目的地用于检测a35r蛋白中的应用；

44、(2)如前所述的抗体、如前所述的多核苷酸分子、如前所述的表达载体、如前所述的重组宿主细胞、如前所述的免疫偶联物、检测试剂或检测试剂盒在制备用于检测和/或辅助检测a35r蛋白的检测产品中的应用；

45、(3)如前所述的抗体、如前所述的多核苷酸分子、如前所述的表达载体、如前所述的重组宿主细胞、如前所述的免疫偶联物、检测试剂或检测试剂盒在制备用于诊断和/或辅助诊断猴痘病毒感染性疾病的诊断产品中的应用。

46、此外，本发明还提供了一种诊断猴痘病毒感染性疾病的方法，所述方法包括：采用本发明如前所述的抗体、如前所述的免疫偶联物、如前所述的检测试剂和/或如前所述的检测试剂盒对受试者来源的待测样品进行检测，通过抗原抗体反应来检测待测样品中a35r蛋白的水平。

47、进一步，可采用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法检测待测样品中a35r蛋白的存在。可以体内或体外进行a35r蛋白的检测。适用于检测a35r蛋白存在与否的方法的实例包括但不限于：elisa、facs、ria等。