一种基于LAMP及HNB指示剂的水禽细小病毒检测方法

本发明涉及生物检测，具体涉及一种基于lamp及hnb指示剂的水禽细小病毒检测方法。

背景技术：

1、水禽细小病毒主要包括鹅细小病毒(gpv)和番鸭细小病毒(mdpv)，目前，实验室诊断可依据病毒分离鉴定、特异抗体检查或者pcr等方法确诊水禽细小病毒，但这些检测方法周期较长、所需实验设备往往比较昂贵、成本较高，不适用于临床一线应用。环介导等温扩增(lamp)技术是一种恒温条件下扩增基因的新型分子生物学诊断技术。这种诊断技术是依靠能够识别靶序列6个特异区域的4或6条特异性引物和具有强链置换活性的bst dna聚合酶，实现目标序列仅在恒温水浴锅中水浴30-90min即可完成扩增反应。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于lamp及hnb指示剂的水禽细小病毒检测方法，包括以下步骤：

2、步骤一：病毒株、实验仪器和实验试剂准备；

3、步骤二：引物设计与合成；

4、步骤三：提取病毒核酸；

5、步骤四：lamp检测反应的建立和条件优化；

6、步骤五：试验lamp检测技术的特异性；

7、步骤六：试验lamp检测反应的敏感性；

8、步骤七：lamp检测技术的临床样品应用。

9、优选的，所述步骤一中，病毒株包括：鹅细小病毒(goose parvovirus,gpv)、鹅圆环病毒(goose circovirus,gocv)、番鸭细小病毒(muscovy duck parvovirus,mdpv)、禽腺病毒血清4型(fowl adenovirus serotype4,fadv-4)、新型鹅星状病毒(novel gooseastrovirus,n-gastv)、鸭圆环病毒(duck circovirus,ducv)和h9亚型禽流感病毒(avianinfluenza virus subtype h9,aiv-h9)；

10、实验仪器包括：电热恒温水浴锅、超低温高速冷冻离心机、迷你离心机、掌上离心机、微量分光光度计、pcr仪、梯度pcr仪、电泳仪、电子分析天平、凝胶成像系统、移液器、超净工作台；

11、实验试剂包括：病毒基因组dna/rna提取试剂盒、2×rapid taq master mix、2×lamp master mix试剂盒、无水乙二醇、羟基萘酚蓝(hnb)指示染料、25mm mgcl2溶液；cdna第一链合成预混液、核酸染料和dl2000 dna marker；pbs缓冲液和tae缓冲液；琼脂糖。

12、优选的，所述步骤二中，引物为一组，分为内引物和外引物，mdpv-gpv-fip、mdpv-gpv-bip为内引物，mdpv-gpv-f3、mdpv-gpv-b3为外引物；

13、其中，mdpv-gpv-f3的核苷酸序列为：

14、5′-gcatctggaacatggagca-3′

15、mdpv-gpv-b3的核苷酸序列为：

16、5′-tgagacatat atctcccgagaaca-3′；

17、mdpv-gpv-fip的核苷酸序列为：

18、5′-ttcgtcctggttgaactgattcca-gtgaatctac cgatggtgacc-3′；

19、mdpv-gpv-bip的核苷酸序列为：

20、5′-ttcaactggaagaaggcagtgagt-aaagaccgtactttgccctg-3′。

21、优选的，所述步骤三中，提取病毒核酸的方式如下，按照dna/rna kit病毒核酸提取试剂盒说明书，分别提取鹅细小病毒(gpv)、番鸭细小病毒(mdpv)、新型鹅星状病毒(n-gastv)、鹅圆环病毒(gocv)、鸭圆环病毒(ducv)、h 9亚型禽流感病毒(aiv-h9)和禽腺病毒血清4型(fadv-4)的基因组,并吸出10μl n-gastv和aiv-h9的rna分别逆转录成20μl的cdna，将所有处理好的核酸均置于冰柜-20℃冷冻储存备用。

22、优选的，所述步骤四中，25μl的lamp总反应体系为12.5μl的2×lamp master mix、0.5μl的bst dna聚合酶、核酸模板为2μl，10μm的外引物各加0.5μl、10μm的内引物各加2.0μl、外加dd h2o补足到25μl，lamp反应容易出现假阳性结果，使用高压灭菌后的过滤吸头。

23、采用调整反应时间和作用温度的方法来筛选最佳反应条件，通过控制lamp体系中单一变量来进行反应条件的优化，反应时间分别选择30min、40min、50min、60min、70min、80min，温度梯度设置为58℃、60℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃，最后再80℃恒温水浴反应10min灭活dna polymerase，每个反应梯度均设置3个重复。

24、水浴扩增结束后，分别吸取4μl扩增反应液和6μl dl2000 dna marker在2％的琼脂糖凝胶上进行39min 110v恒定电压、100ma恒定电流的电泳反应，将可以检测到有最明显特征性梯形条带的最低温度和最短时间设置为lamp反应的最佳反应温度和作用时间。

25、优选的，所述步骤五中，分别将gpv、mdpv、gocv、ducv、fadv-4的基因组dna和n-gastv、aiv-h9的cdna作为模板，配制25μllamp反应体系，并设置一个以高压灭菌去离子水为模板的阴性对照，每个反应重复3次。混匀离心后，进行lamp恒温水浴扩增，反应结束后，分别吸取4μl扩增反应液，用2％琼脂糖凝胶电泳39min，检验上述反应条件优化后的lamp方法的特异性。

26、优选的，所述步骤六中，采用微量核酸蛋白浓度测定仪检测提取的gpv和mdpv基因组dna的原始浓度，将初始浓度为50ng/μl的核酸原液用dd h2o调整成10ng/μl，并将此浓度的dna进行10倍梯度稀释，灵敏性试验设置8个浓度梯度：1ng/μl、1×10-2ng/μl、1×10-3ng/μl、1×10-4ng/μl、1×10-5ng/μl、1×10-6ng/μl以及1×10-7ng/μl。分别将这8个浓度的核酸作为模板进行lamp检测，同时设置一个高压灭菌dd h2o为阴性对照，每个样品3个重复，按照前期优化好的lamp反应参数探究该检测技术的最低检测浓度。

27、优选的，所述步骤七中，取来自不同养殖场的10份水禽临床组织，提取核酸作为模板，按照优化后的lamp检测技术对其进行检测，同时所有病料也使用普通pcr进行同步检测，检验lamp检测方法与常规pcr检测的符合度。

28、本发明的有益效果如下：

29、本发明以gpv和mdpv的ns基因为检测靶基因，设计了一组特异性lamp引物，建立了恒温快速诊断方法，并做了初步临床应用试验。同时，将该检测技术与羟基萘酚蓝(hnb)变色染料相结合，成功建立了lamp-hnb可视化诊断方法，能够为基层部门以及现场检测水禽细小病毒提供一种快速、便捷的技术手段。

30、羟基萘酚蓝(hnb)是可搭配lamp技术使用的变色染料，该指示剂可与反应体系中的mg2+结合形成复合物，肉眼直接观察呈现出紫罗兰色；lamp扩增过程中可产生大量的焦磷酸盐，而该盐类可将mg2+螯合掉，这使得hnb的颜色呈现为天蓝色，相比于其它传统的诊断技术，该方法无需配备贵重的检测仪器，且可以凭借肉眼直接判断出检测结果。

31、本发明建立了水禽细小病毒的lamp检测方法，并对该方法的特异性、灵敏性进行了研究。结果显示该lamp检测体系的最佳反应条件为65℃反应1h、80℃反应10min。该方法特异性良好，仅能扩增鹅细小病毒和番鸭细小病毒，而其他常见水禽病毒的检测结果均为阴性；gpv和mdpv的最低检出浓度均为1×10-5ng/μl；lamp-hnb的可视化检测显示阳性扩增结果呈现天蓝色，阴性为紫罗兰色，特异性与灵敏度与lamp方法一致。将优化后的lamp检测技术及其可视化处理方法应用于临床样本的检验，并与常规pcr作对比，三者检测结果一致。

32、lamp检测技术是分子生物学诊断方法的一种，但其不需要昂贵精密的实验设备，无需经过复杂的变温程序和反复的温度循环，仅在恒温水浴锅中就可实现高效特异地扩增。本方法实验条件要求低，操作快速便捷，且具有高效，特异，灵敏等优点。尤其是lamp-hnb可视化检测方法，不仅避免了开盖污染问题，而且无需进行琼脂糖凝胶电泳，可以直接肉眼观察检测结果，进一步缩短了lamp方法所需时间和简化了诊断步骤。lamp检测方法具有较高的临床应用价值，其已可以合格地检测临床样品，且更加符合养殖场和临床一线对于快速检测的要求，该检测技术为防控gpv和mdpv提供了一种新的有效检测手段。