1.一种基于lamp及hnb指示剂的水禽细小病毒检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
2.根据权利要求1所述的一种基于lamp及hnb指示剂的水禽细小病毒检测方法,其特征在于:所述步骤一中,病毒株包括:鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鹅圆环病毒、禽腺病毒血清4型、新型鹅星状病毒、鸭圆环病毒和h9亚型禽流感病毒;
3.根据权利要求1所述的一种基于lamp及hnb指示剂的水禽细小病毒检测方法,其特征在于:所述步骤二中,引物为一组,分为内引物和外引物,mdpv-gpv-fip、mdpv-gpv-bip为内引物,mdpv-gpv-f3、mdpv-gpv-b3为外引物;
4.根据权利要求1所述的一种基于lamp及hnb指示剂的水禽细小病毒检测方法,其特征在于:所述步骤三中,提取病毒核酸的方式如下,分别提取鹅细小病毒、番鸭细小病毒、新型鹅星状病毒、鹅圆环病毒、鸭圆环病毒、h9亚型禽流感病毒和禽腺病毒血清4型的基因组,并吸出10μl n-gastv和aiv-h9的rna分别逆转录成20μl的cdna,将所有处理好的核酸置于冰柜-20℃冷冻储存备用。
5.根据权利要求1所述的一种基于lamp及lamp-hnb的水禽细小病毒检测方法,其特征在于:所述步骤四中,25μl的lamp总反应体系为12.5μl的lamp mastermix、0.5μl的bstdna聚合酶、核酸模板为2μl,10μm的外引物各加0.5μl、10μm的内引物各加2.0μl、外加ddh2o补足到25μl,采用调整反应时间和作用温度的方法来筛选最佳反应条件。
6.根据权利要求1所述的一种基于lamp及hnb指示剂的水禽细小病毒检测方法,其特征在于:所述步骤五中,分别将gpv、mdpv、gocv、ducv、fadv-4的基因组dna和n-gastv、aiv-h9的cdna作为模板,配制25μl lamp反应体系,并设置一个以高压灭菌去离子水为模板的阴性对照,每个反应重复3次,混匀离心后,进行lamp恒温水浴扩增,反应结束后,分别吸取4μl扩增反应液,用2%琼脂糖凝胶电泳39min,检验上述反应条件优化后的lamp方法的特异性。
7.根据权利要求1所述的一种基于lamp及hnb指示剂的水禽细小病毒检测方法,其特征在于:所述步骤六中,采用微量核酸蛋白浓度测定仪检测提取的gpv和mdpv基因组dna的原始浓度,将初始浓度为50ng/μl的核酸原液用ddh2o调整成10ng/μl,并将此浓度的dna进行10倍梯度稀释,灵敏性试验设置8个浓度梯度:1ng/μl、1×10-2ng/μl、1×10-3ng/μl、1×10-4ng/μl、1×10-5ng/μl、1×10-6ng/μl以及1×10-7ng/μl。
8.根据权利要求1所述的一种基于lamp及hnb指示剂的水禽细小病毒检测方法,其特征在于:所述步骤七中,取来自不同养殖场的10份水禽临床组织,提取核酸作为模板,按照优化后的lamp检测技术对其进行检测,同时所有病料也使用普通pcr进行同步检测,检验lamp检测方法与常规pcr检测的符合度。