一种提高罗伊氏乳杆菌低温冷冻干燥稳定性的方法

本发明属于生物，具体涉及一种提高罗伊氏乳杆菌低温冷冻干燥稳定性的方法。

背景技术：

1、罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)是卫生部于2003年批准的新型益生菌，不仅具有乳酸菌的优势，如分泌乳酸、酶类发挥益生菌效应，还可产化学成分为3-羟基丙醛(3-hpa)的广谱抗菌物质罗伊氏菌素。3-hpa能够不被代谢稳定积累并分泌于胞外，可有效抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母、真菌和病原虫等的生长，可在畜禽养殖中作为抗生素替代物，常被用于养殖、防腐、疾病治疗等领域中。

2、益生菌常以液体发酵形式制备菌液，微生物在发挥作用时必须要保证一定数量的活菌状态。然而，液体状态时的菌液不易长期保存，会发生菌体裂解死亡，使益生菌活菌数减少，降低益生菌功效，造成生产损失，严重限制了益生菌的市场会应用。目前常将液体益生菌制备成固体干粉，以延长益生菌产品货架期。低温冷冻干燥具有存活率高、成本低、干燥后菌株发酵活力好等优点，常被用于制备益生菌干粉，便于运输存储。

3、然而，影响罗伊氏乳杆菌冷冻干燥活菌存活率的原因多样且复杂，如稳定剂、菌株自身特性、冷冻干燥方法等。目前常用的罗伊氏乳杆菌冷冻干燥为提高存活率加入了稳定保护剂，但仍表现活菌存活率低、成本高等问题。因此，研究一种新的罗伊氏乳杆菌冷冻干燥方法，提高益生菌活菌存活率，对于罗伊氏乳杆菌产品的开发具有重要的意义。

技术实现思路

1、针对现有技术中所存在的问题，本发明旨在提供一种提高罗伊氏乳杆菌低温冷冻干燥稳定性的方法。本发明方法可以减少罗伊氏乳杆菌冷冻干燥过程中的活性损失。

2、本发明提高罗伊氏乳杆菌低温冷冻干燥稳定性的方法，是在罗伊氏乳杆菌发酵后，通过离心获取菌体，在菌体中加入质量浓度0.5％-30％保护剂，将混合物冷冻干燥后获得罗伊氏乳杆菌冻干粉。

3、所述罗伊氏乳杆菌购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号cgmcc1.3222。

4、所述罗伊氏乳杆菌发酵菌体制备包括发酵和离心。

5、进一步地，所述发酵为，将罗伊氏乳杆菌甘油保藏管菌种划线于mrs琼脂培养基平板中，于20-37℃厌氧培养箱中24-48h，挑选单菌落至含有5-10ml的mrs培养基中的试管中，于20-37℃厌氧培养箱中静置培养24-48h后获得种子发酵液。

6、进一步地，以体积比1-5％的比例，将罗伊氏乳杆菌种子发酵液接种至100-1000ml的mrs培养基中，于20-37℃厌氧培养箱中静置培养24-48h，获得罗伊氏乳杆菌发酵液。

7、进一步地，取1-10ml发酵液于4-25℃、5000-12000rpm下离心5-20min，获得罗伊氏乳杆菌发酵菌体。

8、所述保护剂为由海藻糖、山梨醇、甘油、蔗糖、麦芽糊精、低聚果糖中的至少一种配制的无菌水溶液，质量浓度0.5-30％。

9、进一步地，所述保护剂体系浓度为质量浓度5-20％的海藻糖溶液，或为质量浓度10-20％的山梨醇溶液，或为质量浓度1-2％的甘油溶液，或为质量浓度10-20％的蔗糖溶液，或为质量浓度5-10％的麦芽糊精溶液，或为质量浓度10-15％的低聚果糖溶液。

10、进一步优选，所述保护剂为质量浓度15％的山梨醇溶液，或为质量浓度15％的蔗糖溶液，或为质量浓度1.5％的甘油溶液，或为质量浓度10％的麦芽糊精溶液。

11、更进一步，所述保护剂为质量浓度15％的山梨醇溶液、质量浓度15％的蔗糖溶液、质量浓度1.5％的甘油溶液、质量浓度10％的麦芽糊精溶液中的多种复配构成。

12、其中优选甘油+麦芽糊精复配，蔗糖+甘油+麦芽糊精复配，以及蔗糖+甘油+山梨醇+麦芽糊精复配。

13、所述冷冻混合液置于-80℃预冷12-24h后，在-20℃下冷冻干燥24-72h。冷冻干燥后，在冷冻干粉中加入与冷冻前等体积的无菌水重悬冻干粉，并涂布于mrs琼脂平板，于20-37℃厌氧培养箱中培养计菌落数量，比较冷冻前后罗伊氏乳杆菌平板培养活菌数变化，计算罗伊氏乳杆菌冷冻干燥菌体存活率。

14、本发明有益效果体现在：

15、本发明提供了一种罗伊氏乳杆菌真空冷冻干燥方法，并对保护剂种类、添加量等进行了优化，优化后复合保护剂的最佳配方为蔗糖(体系质量浓度15％)、甘油(体系质量浓度1.5％)、麦芽糊精(体系质量浓度10％)，冻干后罗伊氏乳杆菌存活率为88.5％。与现有技术相比，提高了菌体冻干存活率，降低了成本，如相比专利cn 116445287a公布的一种益生菌真空冷冻干燥，其实施例中存活率最高为75.23％。

16、本发明通过胆盐耐受性试验证实，罗伊氏乳杆菌冻干粉对胆盐具有更高的耐受性，所加保护剂提高了罗伊氏乳杆菌对肠道胆盐环境的抵抗能力，使罗伊氏乳杆菌作为一种益生菌具有更有效的应用能力和治疗效果。

技术特征：

1.一种提高罗伊氏乳杆菌低温冷冻干燥稳定性的方法，其特征在于：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

技术总结
本发明公开了一种提高罗伊氏乳杆菌低温冷冻干燥稳定性的方法，在罗伊氏乳杆菌发酵后，通过离心获取菌体，在菌体中加入质量浓度0.5％‑30％保护剂，将混合物冷冻干燥后获得罗伊氏乳杆菌冻干粉。本发明对保护剂种类、添加量等进行了优化，与现有技术相比，提高了菌体冻干存活率，降低了成本。本发明通过胆盐耐受性试验证实，罗伊氏乳杆菌冻干粉对胆盐具有更高的耐受性，所加保护剂提高了罗伊氏乳杆菌对肠道胆盐环境的抵抗能力，使罗伊氏乳杆菌作为一种益生菌具有更有效的应用能力和治疗效果。

技术研发人员：刘祚军,尹强,夏文胜,方勇
受保护的技术使用者：安徽省农业科学院农业工程研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/3/4