固定化共表达马来顺反异构酶和天冬氨酸酶基因工程菌利用马来酸生产L-天冬氨酸的方法与流程

本发明涉及发酵工程，具体涉及固定化共表达马来顺反异构酶和天冬氨酸酶基因工程菌利用马来酸生产l-天冬氨酸的方法。

背景技术：

1、l-天冬氨酸在医药领域有着广泛的用途，可用于治疗心脏病，用作肝功能促进剂、氨解毒剂、疲劳消除剂和氨基酸输液成分等，此外，工业上l-天冬氨酸还可作用合成甜味剂的原料。

2、l-天冬氨酸的制法有合成法和发酵法。其中，合成法主要是以马来酸或富马酸或它们的酯为原料，在加压下用氨处理，然后水解。较容易合成得到外消旋天冬氨酸，但至今还没有理想的拆分外消旋体的方法。发酵法是在酶作用下，将富马酸与氨加成，可高收率地得到产品。采用这种方法只生成左旋体，收率高，因此是工业生产的主要方法。然而，目前发酵法也存在一定的缺陷：1、游离细胞在发酵后期一般需要通过离心、过滤等方法从发酵液中分离出来，增加工艺环节，能耗大。2、发酵后的菌体往往不能回收和重复利用，造成大量的浪费，导致生产成本较高。

3、美国专利(公开号us10837036b2；其中国同族专利公开号cn108103120a)提供了一种双酶偶联全细胞催化马来酸合成l-天冬氨酸的方法，该技术方案中给出了偶联表达马来酸顺反异构酶和l-天冬氨酸裂解酶的重组菌株的构建方法，是以大肠杆菌为宿主，表达以prsfduet-1为表达载体构建的重组表达载体prsfduet-1-maia-aspa。基于此公开技术所构建的重组菌株，能够以马来酸为底物制备l-天冬氨酸。

技术实现思路

1、本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供固定化共表达马来顺反异构酶和天冬氨酸酶基因工程菌利用马来酸生产l-天冬氨酸的方法，以解决l-天冬氨酸的常规发酵生产方法中，发酵后菌体不能回收和重复利用的技术问题。

2、本发明要解决的另一技术问题是，在l-天冬氨酸的发酵生产方法中，如何省去菌体分离步骤。

3、为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

4、固定化共表达马来顺反异构酶和天冬氨酸酶基因工程菌利用马来酸生产l-天冬氨酸的方法，包括：将所述基因工程菌的菌体用生理盐水溶液配制成菌悬液，取菌悬液加入硅藻土，搅拌，加入聚乙烯醇，然后加入戊二醛水溶液，反应，得到固化的菌体，将所述固化的菌体抽滤并用生理盐水洗涤后与马来酸混合进行转化反应，得到l-天冬氨酸。

5、作为优选，该方法包括：将所述基因工程菌的菌体用生理盐水溶液配制成50g/l的菌悬液，取50ml菌悬液加入0.8g硅藻土，搅拌0.5h，加入2ml100g/l的聚乙烯醇，然后加入1ml 20％的戊二醛水溶液，于室温下反应1-2h，得到固化的菌体，将所述固化的菌体抽滤并用生理盐水洗涤3次于4℃备用，而后与马来酸混合进行转化反应，得到l-天冬氨酸。

6、作为优选，所述硅藻土在使用前进行以下预处理：将硅藻土放于盐酸中浸泡，然后用去离子水洗涤至中性，抽滤，烘干备用。

7、作为优选，所述硅藻土在使用前进行以下预处理：将硅藻土放于2mol/l盐酸中浸泡5h，然后用去离子水洗涤至中性，抽滤，烘干备用。

8、作为优选，所述基因工程菌的菌体是通过以下方法培养得到的：将所述基因工程菌的菌种接种至lb培养基中，加入卡那霉素及氨苄霉素，培养后将菌种转接至tb液体培养基中，加入卡那霉素，培养后降温，同时加入iptg进行诱导表达，诱导表达完成后将菌液进行离心收集菌体。

9、作为优选，所述基因工程菌的菌体是通过以下方法培养得到的：将所述基因工程菌的菌种以5％接种量接种至lb培养基中，加入终浓度为50μg/ml的卡那霉素及50μg/ml的氨苄霉素，温度37℃，转速200rpm，培养7.5h，连续培养二代；然后将菌种转接至tb液体培养基中，加入终浓度为50μg/ml的卡那霉素，温度37℃，转速200rpm，当od600达到0.6-0.8时，降温到30℃，同时加入终浓度为0.5mmol·l-1的iptg进行诱导表达14-16h；诱导表达完成后将菌液进行离心收集菌体。

10、作为优选，每升lb培养基中含有：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，nacl10.0g；每升tb液体培养基中含有：蛋白胨12.0g，酵母粉24.0g，kh2po423.1g，k2hpo4 125.4g。

11、作为优选，所述tb液体培养基的ph值为7。

12、作为优选，所述与马来酸混合进行转化反应，包括：在容器中将固定化菌体和马来酸混合后培养，培养后取部分反应液离心，将离心得到的上清液进行过滤处理后，用高效液相色谱仪检测l-天冬氨酸的含量，并计算固定化细胞转化l-天冬氨酸的转化率；第一批次反应结束之后，将固定化细胞通过抽滤回收，进行下一批反应。

13、作为优选，所述与马来酸混合进行转化反应，包括：锥形瓶中加入50g/l的固定化菌体和300g/l的马来酸进行转化反应，反应液ph为70，温度37℃，反应时间24h，转速200rpm；24h后取部分反应液离心，将离心得到的上清液进行过滤处理后，用高效液相色谱仪检测l-天冬氨酸的含量，并计算固定化细胞转化l-天冬氨酸的转化率；第一批次反应结束之后，将固定化细胞通过抽滤回收，进行下一批反应；重复反应10批。

14、本发明公开了固定化共表达马来顺反异构酶和天冬氨酸酶基因工程菌利用马来酸生产l-天冬氨酸的方法。该技术方案以固定化的重组大肠杆菌细胞做为生物催化剂催化马来酸生产l-天冬氨酸，固定化细胞总酶活回收>60％。应用本发明，当底物浓度300g/l，反应时间24h时，转化率可达60％以上。将固定化细胞回收利用，重复反应10批，酶活没有明显下降，各批次底物转化率均大于50％。与常规发酵法生产l-天冬氨酸的工艺相比，本发明省去了菌体离心分离步骤，而且固定化细胞可回收后重复利用，从而提高了生产效率，降低了生产成本。

技术特征：

1.固定化共表达马来顺反异构酶和天冬氨酸酶基因工程菌利用马来酸生产l-天冬氨酸的方法，其特征在于，包括：将所述基因工程菌的菌体用生理盐水溶液配制成菌悬液，取菌悬液加入硅藻土，搅拌，加入聚乙烯醇，然后加入戊二醛水溶液，反应，得到固化的菌体，将所述固化的菌体抽滤并用生理盐水洗涤后与马来酸混合进行转化反应，得到l-天冬氨酸。

2.根据权利要求1所述的固定化共表达马来顺反异构酶和天冬氨酸酶基因工程菌利用马来酸生产l-天冬氨酸的方法，其特征在于，包括：将所述基因工程菌的菌体用生理盐水溶液配制成50g/l的菌悬液，取50ml菌悬液加入0.8g硅藻土，搅拌0.5h，加入2ml 100g/l的聚乙烯醇，然后加入1ml 20％的戊二醛水溶液，于室温下反应1-2h，得到固化的菌体，将所述固化的菌体抽滤并用生理盐水洗涤3次于4℃备用，而后与马来酸混合进行转化反应，得到l-天冬氨酸。

3.根据权利要求1或2所述的固定化共表达马来顺反异构酶和天冬氨酸酶基因工程菌利用马来酸生产l-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述硅藻土在使用前进行以下预处理：将硅藻土放于盐酸中浸泡，然后用去离子水洗涤至中性，抽滤，烘干备用。

4.根据权利要求3所述的固定化共表达马来顺反异构酶和天冬氨酸酶基因工程菌利用马来酸生产l-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述硅藻土在使用前进行以下预处理：将硅藻土放于2mol/l盐酸中浸泡5h，然后用去离子水洗涤至中性，抽滤，烘干备用。

5.根据权利要求1所述的固定化共表达马来顺反异构酶和天冬氨酸酶基因工程菌利用马来酸生产l-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述基因工程菌的菌体是通过以下方法培养得到的：将所述基因工程菌的菌种接种至lb培养基中，加入卡那霉素及氨苄霉素，培养后将菌种转接至tb液体培养基中，加入卡那霉素，培养后降温，同时加入iptg进行诱导表达，诱导表达完成后将菌液进行离心收集菌体。

6.根据权利要求5所述的固定化共表达马来顺反异构酶和天冬氨酸酶基因工程菌利用马来酸生产l-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述基因工程菌的菌体是通过以下方法培养得到的：将所述基因工程菌的菌种以5％接种量接种至lb培养基中，加入终浓度为50μg/ml的卡那霉素及50μg/ml的氨苄霉素，温度37℃，转速200rpm，培养7.5h，连续培养二代；然后将菌种转接至tb液体培养基中，加入终浓度为50μg/ml的卡那霉素，温度37℃，转速200rpm，当od600达到0.6-0.8时，降温到30℃，同时加入终浓度为0.5mmol·l-1的iptg进行诱导表达14-16h；诱导表达完成后将菌液进行离心收集菌体。

7.根据权利要求5或6所述的固定化共表达马来顺反异构酶和天冬氨酸酶基因工程菌利用马来酸生产l-天冬氨酸的方法，其特征在于，每升lb培养基中含有：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，nacl 10.0g；每升tb液体培养基中含有：蛋白胨12.0g，酵母粉24.0g，kh2po4 23.1g，k2hpo4 125.4g。

8.根据权利要求5或6所述的固定化共表达马来顺反异构酶和天冬氨酸酶基因工程菌利用马来酸生产l-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述tb液体培养基的ph值为7。

9.根据权利要求1所述的固定化共表达马来顺反异构酶和天冬氨酸酶基因工程菌利用马来酸生产l-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述与马来酸混合进行转化反应，包括：在容器中将固定化菌体和马来酸混合后培养，培养后取部分反应液离心，将离心得到的上清液进行过滤处理后，用高效液相色谱仪检测l-天冬氨酸的含量，并计算固定化细胞转化l-天冬氨酸的转化率；第一批次反应结束之后，将固定化细胞通过抽滤回收，进行下一批反应。

10.根据权利要求9所述的固定化共表达马来顺反异构酶和天冬氨酸酶基因工程菌利用马来酸生产l-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述与马来酸混合进行转化反应，包括：锥形瓶中加入50g/l的固定化菌体和300g/l的马来酸进行转化反应，反应液ph为70，温度37℃，反应时间24h，转速200rpm；24h后取部分反应液离心，将离心得到的上清液进行过滤处理后，用高效液相色谱仪检测l-天冬氨酸的含量，并计算固定化细胞转化l-天冬氨酸的转化率；第一批次反应结束之后，将固定化细胞通过抽滤回收，进行下一批反应；重复反应10批。

技术总结
本发明公开了固定化共表达马来顺反异构酶和天冬氨酸酶基因工程菌利用马来酸生产L‑天冬氨酸的方法，属于发酵工程技术领域。本发明首先对基因工程菌进行培养扩增，而后进行固定化，再利用固定化菌体与马来酸进行转化反应制得L‑天冬氨酸，反应结束之后，固定化细胞可通过抽滤回收进行下一批反应。应用本发明，当底物浓度300g/L，反应时间24h时，转化率可达60％以上。将固定化细胞回收利用，重复反应10批，酶活没有明显下降，各批次底物转化率均大于50％。与常规发酵法生产L‑天冬氨酸的工艺相比，本发明省去了菌体离心分离步骤，而且固定化细胞可回收后重复利用，从而提高了生产效率，降低了生产成本。

技术研发人员：魏哲,吕厚臣,陈鑫鑫,秦配玲,夏瑶瑶,崔新冉
受保护的技术使用者：山东金洋药业有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/27