一种利用溶解曲线法同时检测10种生殖病原体核酸的恒温扩增检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及一种恒温扩增检测试剂盒，具体涉及一种利用溶解曲线法同时检测10种生殖病原体核酸的恒温扩增检测试剂盒及其应用。

背景技术：

1、泌尿生殖道感染也称之为性传播疾病，是以性接触为主要传播方式的一组疾病，性传播感染是世界范围内重要的公共卫生问题，严重影响患者生活质量，并具有高发病率和致死率的特点。其对生育、婴儿健康、癌症以及孕期并发症具有直接影响，还可加快hiv的传播。

2、目前检测生殖病原体的分子检测技术主要为基于dna检测的pcr荧光定量法及基于rna检测的sat法。pcr荧光定量法一管检测灵敏度高但指标少，一般为1-4个指标，且检测dna无法判断病原体是否存活，可能存在假阳性结果。用于rna检测的sat法，检测灵敏度高，且由于靶标为rna，可以判断病原体是否存活，但其同样存在单管检测靶标较少，一般为1-4个靶标，且由于单管用酶较多，单指标检测成本较高。

3、以rna为检测模板的等温扩增技术，目前主要是以amv为逆转录酶的基于核酸序列的扩增技术及以mmlv为逆转录酶的tma及sat扩增技术，该两种方法扩增原理几乎完全相同，只是逆转录酶种类存在差别。目前国内针对泌尿生殖道病原体检测主要应用的是tma及sat扩增技术。该两种方法的主要区别在于扩增产物的检测方法，tma主要在反应完成后对产物进行hpa及杂交保护检测，该检测方法由于在反应完成后仍然需要开盖进行检测，一定程度增加了污染的可能。

4、sat检测则通过在反应体系中加入诸如分子信标等探针，对反应进行不开盖实时报告及检测技术(200810111479.0，核酸恒温同步放大检测方法及应用)，该方法可在扩增发生产物产生时利用分子信标进行实时检测，利用扩增曲线的有无进行结果的判断，该检测灵敏度高，且不开盖检测，污染可能性小。但该方法目前针对4通道机器单管最多只能分别检测两到三个指标，且实验的rna聚合酶及反转录酶量较多，单个指标成本较高。

5、多通道溶解曲线技术是一种pcr终点检测技术，在pcr扩增结束之后，利用温度的升高实现探针与目的单链的逐渐解链，发生荧光值的变化，通过仪器生成探针熔解曲线。依靠探针tm值的差异，可以在同一管内实现多重检测，使用不同荧光标记的探针，即可实现多通道多重检测。如何将两个维度技术的结合是迫切需要解决的。

技术实现思路

1、为解决检测通量少、单指标检测成本较高的问题，本发明提供一种利用溶解曲线法同时检测10种生殖病原体核酸的恒温扩增检测试剂盒。本发明是等温扩增结合溶解曲线的分析方法，不同于sat方法使用分子信标进行同步放大检测方式，由于等温扩增的产物主要为rna单链，故可以反应完成后的终点检测的溶解曲线分析进行检测，在设计结合探针时，相同荧光通道设计为不同的溶解温度(tm值)，通过溶解曲线溶解峰的差异达到判断不同指标的目的。

2、本发明提供如下技术方案：

3、一种利用溶解曲线法同时检测10种生殖病原体核酸的恒温扩增检测试剂盒，10种生殖病原体为沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、人型支原体、生殖支原体、解脲脲原体、微小脲原体、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、梅毒螺旋体、阴道毛滴虫，试剂盒包括：

4、1)扩增反应液：含10-150mm kcl，5-30mm mgcl2，10-150mm tris-hcl，0.1-5mmdntp,0.1-8mm ntp，3％-30％甘油，1-20mm dtt，0.1-5mm精氨酸，0.05-2mm甲酰胺，0.05-2μm扩增引物1，0.05-2μm扩增引物2；

5、扩增引物有十对：沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、人型支原体、生殖支原体、解脲脲原体、微小脲原体、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、梅毒螺旋体、阴道毛滴虫，具体的：

6、(1)沙眼衣原体的扩增引物：

7、ct-扩增引物1：tttgagttctgcttcctccttgc

8、ct-扩增引物2：aattctaatacgactcactataggggcaaggatcgcaaggatctcc

9、(2)淋病奈瑟菌的扩增引物：

10、ng-扩增引物1：cgcacaactctcaaaccgaag

11、ng-扩增引物2：aattctaatacgactcactatagggcagaagtgcgtttggagaagtc

12、(3)人型支原体的扩增引物：

13、mh-扩增引物1：tttggtcaagtcctgcaacga

14、mh-扩增引物2：aattctaatacgactcactatagggccccaccttcctcccagtta

15、(4)生殖支原体的扩增引物：

16、mg-扩增引物1：catagttcattatgcgcaccagttacttg

17、mg-扩增引物2：aattctaatacgactcactatagggctctttaacaacaggggttgggat tag

18、(5)解脲脲原体的扩增引物：

19、uu-扩增引物1：cattgatgttgcacaaggag

20、uu-扩增引物2：aattctaatacgactcactatagggcgtgattttaatgtatcggctttc

21、(6)微小脲原体的扩增引物：

22、up-扩增引物1：cattgatgttgcacaaggag

23、up-扩增引物2：aattctaatacgactcactatagggcgtgattttaatgtatcggctttc

24、(7)单纯疱疹病毒1型的扩增引物：

25、hsv1-扩增引物1：tcctcgaagtacacgtagccc

26、hsv1-扩增引物2：aattctaatacgactcactatagggtacagccgccccctggt

27、(8)单纯疱疹病毒2型的扩增引物：

28、hsv2-扩增引物1：tcctcgaagtacacgtagccc

29、hsv2-扩增引物2：aattctaatacgactcactatagggtacagccgccccctggt

30、(9)梅毒螺旋体的扩增引物：

31、tp-扩增引物1：cgctatttctcgtcgctggt

32、tp-扩增引物2：aattctaatacgactcactataggggaacgtgcctgcctcccc

33、(10)阴道毛滴虫的扩增引物：

34、tv-扩增引物1：ggctgatgaggagtagggttt

35、tv-扩增引物2：

36、aattctaatacgactcactatagggggcggagaaaaatagtatgcgttgc

37、2)酶反应液：1-800u逆转录酶，10-1000u rna聚合酶，0-200u rna酶抑制剂，10％-50％甘油10-200mm tris-hcl，20-200mm kcl，0.1-5mm dtt，0.1-1μg/μl bsa，0-0.5u核糖核酸酶h；

38、3)探针0.05-2μm，探针是一种或多种荧光探针，荧光探针的类型为taqman荧光探针、分子信标或蝎型探针。

39、酶反应液含有四种酶如下：

40、rna聚合酶:t7 rna聚合酶、t3 rna聚合酶、m13 rna聚合酶、sp6 rna聚合酶；

41、逆转录酶:amv反转录酶或mmlv反转录酶；

42、具有降解rna&dna杂交链中rna链活性的核糖核酸酶h；

43、抑制核糖核酸酶a，b，c的鼠源或人源的rna酶抑制剂。

44、扩增引物1与目的核酸负链5'杂交的一段核酸序列；

45、扩增引物2的5'端为rna聚合酶(t7 rna聚合酶，t3 rna聚合酶，m13 rna聚合酶，sp6 rna rna聚合酶)启动子，3'端与目的核酸3'杂交的一段核酸序列。

46、探针一端标记有荧光基团(包括atto425、fam、vic/hex/joe、rox、cy5，cy5.5)，探针另一端标记有淬灭基团(包括mgb，bhq1,bhq2,bhq3,dabcyl等)。

47、荧光探针序列为：

48、(1)沙眼衣原体的荧光探针：

49、ct-荧光探针：fam-ctgcctgtggggaatcctgctga-bhq1

50、(2)淋病奈瑟菌的扩增引物：

51、ng-荧光探针：fam-tttcttacgcccacgg-bhq1

52、(3)人型支原体的扩增引物：

53、mh-荧光探针：fam-actaacattaagttgaggactc-mgb

54、(4)生殖支原体的扩增引物：

55、mg-荧光探针：hex-ggtgtggatcgagcg-bhq1

56、(5)解脲脲原体的扩增引物：

57、uu-荧光探针：hex-ttgtccgcctttacgag-mgb

58、(6)微小脲原体的扩增引物：

59、up-荧光探针：hex-ttgaccacccttacg-mgb

60、(7)单纯疱疹病毒1型的扩增引物：

61、hsv1-荧光探针：rox-cggctgacgcgcgat-bhq2

62、(8)单纯疱疹病毒2型的扩增引物：

63、hsv2-荧光探针：rox-acccgcgacgcgctcg-bhq2

64、(9)梅毒螺旋体的扩增引物：

65、tp-荧光探针：rox-ctgaatgtggaggagcagtcgacggc-bhq2

66、(10)阴道毛滴虫的扩增引物：

67、tv-荧光探针：cy5-caacttaaacagatccagagttagtcga-bhq3

68、同一荧光通道、不同指标的探针与目的核酸负链杂交的tm值不同,其在体系中的tm值为45-80摄氏度。

69、检测方法：

70、将扩增反应液与模板混合后37-70℃孵育1-30min后，加入酶反应液继续37-50℃孵育30-120min扩增反应结束后，温度以0.01-0.1℃缓慢上升至65-90℃，开始收集溶解曲线，观察仪器溶解峰型，判断是否存在目的核酸。

71、本发明预期可一管同时检测10种泌尿生殖道病原体，包括沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis，ct)，淋病奈瑟菌(neisseria gonorrhoeae，ng)，人型支原体(mycoplasmahominis，mh)，生殖支原体(mycoplasma.genitalium，mg)解脲脲原体(ureaplasmaurealyticum，uu)，微小脲原体(ureaplasma parvum,up)，单纯疱疹病毒1型(herpessimplex virus type 1，hsv1)，单纯疱疹病毒2型(herpes simplex virus type 2，hsv2)梅毒螺旋体(treponema pallidum，tp)，阴道毛滴虫(trichomonas vaginalis，tv)。

72、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

73、1、通过等温扩增结合溶解曲线的分析方法，在同一管内能够同时扩增沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、人型支原体、生殖支原体、解脲脲原体、微小脲原体、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、梅毒螺旋体、阴道毛滴虫十个指标，实现多通道多重检测，两个维度技术的结合，可以大大增加检测通量；

74、2、rna检测，判断病原体是否存活，减少假阳性检出，抗生素滥用；

75、3、较常规的sat检测方法单管检测并区分1-4个指标，该发明pcr终点溶解曲线检测单管可检测并区分十个指标，单指标检测成本低；

76、4、闭管检测，且扩增出的核酸产物为rna，不易污染。