共表达TypeV-A型anti-CRISPR蛋白的LbCas12a植物基因组编辑系统的制作方法

本发明属于植物基因工程，涉及共表达type v-a型anti-crispr蛋白的lbcas12a植物基因组编辑系统。

背景技术：

1、2012年，科学家们建立了crispr/cas系统(clustered regμlarly interspacedshort palindromic repeats/crispr-associated system)(cong等2013；mali等2013)，并不断对其进行优化和升级。随后，crispr-cas9系统迅速在水稻、烟草、玉米、马铃薯等二倍体植物，以及棉花、油菜、小麦等多倍体植物中实现了可遗传的基因编辑。

2、2016年，随着type ii型crispr-cas9植物基因组编辑工具的发展，科学家们利用crispr-fncas12a在烟草和水稻中成功实现了基因编辑。随后，type v型crispr-cas系统，如crispr-lbcas12a、crispr-ascas12a、crispr-aacas12a、crispr-bhcas12a等，也在植物领域得到了广泛应用，为植物编辑工具数据库的丰富提供了新的可能性。目前，type v型crispr-cas12a系统中lbcas12a系统在植物中广泛应用，表现出高编辑活性，且其介导的编辑事件主要为多碱基缺失。这一特性使其在编辑蛋白质编码区域、启动子调控元件、mirna等非蛋白编码区域时更具优势。

3、crispr-cas系统作为基因编辑领域的关键工具，已在动植物中得到广泛应用。然而，在其应用过程中，脱靶效应所带来的生物安全问题是最关注的问题之一，这极大地限制了crispr-cas系统在更广泛领域的深入应用。在植物基因组编辑中，为获得特异性基因组编辑的再生材料，目前常用的方法是使用工程化的cas9蛋白或者cas12a蛋白变体系统。虽然这些变体系统能在一定程度上降低脱靶效率，但是相应的靶向位点编辑效率也显著降低。因此，合理控制crispr-cas系统的编辑活性，减少脱靶效应，是当前亟待解决的科学问题。

4、anti-crispr(acr)蛋白是一类天然存在的蛋白，具有抑制crispr-cas系统功能的特性。这些蛋白由多种移动基因元件(如质粒或噬菌体)编码，能够在crispr-cas系统不同阶段抑制其功能。目前已发现超过50种非同源anti-crispr蛋白。

5、针对type v型crispr-cas系统，2018年，joseph bondy-doenmy等在moraxellabovocali 58069菌株中发现了acrva1、acrva2、acrva3蛋白。实验结果显示，acrva1在人类细胞中强烈抑制mbcas12a、mb3cas12a，并对ascas12a、m2bcas12a有中等抑制作用，而对fncas12a的抑制效果较弱；在哺乳动物体内，acrva1基本完全抑制mbcas12a、mb3cas12a，对ascas12a、m2bcas12a、fncas12a的抑制作用较弱。同年，jkyle e.watters等也在moraxellabovocali 58069菌株中发现了acrva1蛋白，并在moraxella bovocali 22581菌株中发现了acrva4、acrva5蛋白。体外切割实验结果显示，acrva1对mbcas12a、ascas12a、m2bcas12a有抑制作用；acrva4、acrva5对mbcas12a、m2bcas12a有抑制作用。哺乳动物体内实验结果显示，acrva1抑制m2bcas12a、ascas12a，而acrva4、acrva5对m2bcas12a有抑制作用。综上可知，应用天然存在的anti-crispr蛋白能够对crispr-cas基因编辑系统进行有效控制。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是在植物中构建一种基于type v-a型anti-crispr共表达的lbcas12a植物基因组编辑系统，对lbcas12a编辑效率有效控制的同时降低其脱靶效率，使其能在植物中得到有效应用。

2、本发明的技术方案是共表达type v-a型anti-crispr蛋白的lbcas12a植物基因组编辑系统，包括lbcas12a核酸酶蛋白表达单元、crrna转录表达单元和anti-crispr蛋白表达单元；anti-crispr蛋白为氨基酸序列如seq id no.1所示acrva1、氨基酸序列如seq idno.2所示acrva4或氨基酸序列如seq idno.3所示acrva5。

3、进一步的，所述anti-crispr蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no.4～6任一所示。

4、具体的，lbcas12a核酸酶蛋白表达单元的结构为启动子-lbcas12a-终止子。

5、进一步的，所述lbcas12a的5’或/和3’端还融合有nls。

6、特别的，所述crrna转录表达克隆单元的结构为启动子-至少1个(hh ribozyme-crrna scaffold-ccdb-hdv ribozyme)-终止子。

7、进一步的，所述anti-crispr蛋白表达单元的结构为启动子-anti-crispr-终止子。

8、特别的，所述启动子为组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子。

9、其中，所述组成型启动子为osubi1、zmubi1或p35s。

10、进一步的，所述诱导型启动子为pxve、plhcp、pposheat2或pop。

11、其中，所述特异性启动子为posrcc3、posrsp5、posgrp7或paer1。

12、具体的，所述终止子为pinii、athsp、nos或t35s。

13、特别的，所述lbcas12a核酸酶蛋白表达单元的核苷酸序列如seq id no.7所示。

14、进一步的，所述crrna转录表达单元的核苷酸序列如seq id no.8所示。

15、本发明还提供含有上述编辑系统的载体、细胞或宿主。

16、进一步的，所述载体为植物表达载体。

17、本发明的有益效果：本发明提供了密码子优化的type v-a型anti-crispr蛋白dna序列，首次在植物中实现共表达anti-crispr蛋白的lbcas12a植物基因组编辑系统的刹车作用。通过降低crispr的靶向效率，可以更精确地调控植物基因。这对于一些需要谨慎调控的基因或需要避免不必要的突变的研究和应用来说是有益的。高效的crispr系统有时可能引发非特异性的副作用，例如在目标基因之外发生的不必要的编辑。通过本发明的植物基因编辑系统还可以降低意外效应的发生概率，使基因编辑更加可控。本发明技术方案体现type v-a型anti-crispr蛋白在植物基因编辑中的应用价值，试验证明其能够有效降低脱靶效率且能在植物中作为抵御crispr-lbcas12a植物基因组编辑工具的盾。引入anti-crispr蛋白能有助于减轻人们对基因编辑可能带来的生物安全性和环境风险的担忧。通过本发明技术方案控制crispr系统，可以减少不受控制的基因扩散和植物的不受控制的行为。此外，对于一些研究项目，研究人员也可能希望有更多的控制权，以便更好地理解基因的功能。通过引入anti-crispr蛋白，研究人员可以调整基因编辑的强度，使其更适应特定研究的需要。