一种利用单质粒合成2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌重组菌株及其构建方法与流程

本发明涉及生物工程，特别是涉及一种利用单质粒合成2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌重组菌株及其构建方法。

背景技术：

1、人乳寡糖(human milk oligosaccharides，简称hmo)是母乳中非常重要的一类营养物质，大多由3～6个糖基组成，迄今已发现了200多种。具有代表性的hmo成分包括2’-岩藻糖基乳糖，2’-fl(cas号：41263-94-9)、3-岩藻糖基乳糖(3-fl)、6’-唾液酸乳糖(6’-sl)、乳糖-n-新四糖(lnnt)等。由于生物合成2’-fl需要过表达的关键酶基因较多，因此多质粒系统的使用在所难免，已报道的2’-岩藻糖基乳糖合成菌株常使用双质粒甚至三质粒、四质粒系统。如huang等人[1]在大肠杆菌bl21(de3)中使用pacycduet-1、petduet-1、pcdfduet-1、pcoladuet-1等多个质粒共存表达来实现2’-fl的从头合成，产量为9.12g/l；chin等人[2]在大肠杆菌bl21star(de3)中使用petduet-1和pcoladuet-1两个质粒共存表达来合成2’-fl，产量为15.4g/l。ni等人[3]在c41(de3)菌株中使用prsfduet-1和petduet-1质粒共表达来合成2’-fl，产量为66.8g/l。

2、但多质粒的共存可能造成宿主代谢负担加重而影响菌株生长，且发酵时需添加多种抗生素，增加了生产成本和下游分离提取难度。另一方面，基于λ-red或crispr-cas9技术的染色体整合手段能够实现无质粒菌株的构建，例如等人[4]在jm109菌株染色体上整合了五个2’-fl合成的关键酶基因，2’-fl在10l发酵罐中的产量为20.3g/l，该菌株不携带任何质粒。

3、由于2’-fl是用于婴幼儿奶粉的食品添加剂，因此生产过程的抗生素使用越少越好，染色体整合形式的工程菌似乎是最优选择。然而，染色体整合的关键酶基因拷贝数一般远低于质粒表达，因此对于低酶活的一些限速酶来说在染色体整合后表达酶活力不足，会造成最终产物产量低于质粒表达。

4、参考文献：

5、[1]huang,d.,yang,k.,liu,j.,xu,y.,wang,y.,wang,r.,liu,b.,feng,l.,2017.metabolic engineering of escherichia coli for the production of 2′-fucosyllactose and 3-fucosyllactose through modular pathwayenhancement.metab.eng.41,23-38.

6、[2]chin,y.w.,seo,n.,kim,j.h.,seo,j.h.,2016.metabolic engineering ofescherichia coli to produce 2′-fucosyllactose via salvage pathway ofguanosine 5′-diphosphate(gdp)-l-fucose:2-fl production from fucose andlactose in e.coli.biotechnol.bioeng.113,2443-2452.

7、[3]ni,z.,li,z.,wu,j.,ge,y.,liao,y.,yuan,l.,chen,x.,yao,j.,2020.multi-path optimization for efficient production of 2′-fucosyllactose in anengineered escherichia coli c41(de3)derivative.front.bioeng.biotechnol.8,611900.

8、[4]f.,seitz,l.,sprenger,g.a.,&albermann,c.(2013).construction of escherichia coli strains with chromosomally integratedexpression cassettes for the synthesis of 2′-fucosyllactose.microbial cellfactories,12,1-13.

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种利用单质粒合成2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌重组菌株及其构建方法，本发明的目的是通过生物工程技术，将2’-岩藻糖基乳糖(2’-fl)生物合成所需的关键酶基因整合到同一个质粒上，并通过ptrc启动子控制基因的转录和表达，最终构建只含有这一种质粒、但能够高效合成2’-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌菌株。本发明提供的单质粒菌株既可以保证关键酶基因有较高的表达拷贝数，而对宿主的代谢压力又相对较小，因此具有一定优势。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供了一种利用单质粒合成2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌重组菌株，所述大肠杆菌重组菌株携带有重组质粒ptrc99a-cbgwfys；

4、所述重组质粒ptrc99a-cbgwfys包含有mancb基因簇、gmdwcag基因簇、fuct基因、lacy基因和seta基因；

5、所述大肠杆菌重组菌株的初始菌株为敲除了lacz基因的大肠杆菌c41(de3)菌株。

6、本发明还提供了一种利用单质粒合成2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌重组菌株的构建方法，包括以下步骤：

7、1)将ptrc99a载体分别与mancb基因簇、gmdwcag基因簇、fuct基因、lacy基因、seta基因连接，分别得到ptrc99a-cb重组质粒、ptrc99a-gw重组质粒、ptrc99a-t重组质粒、ptrc99a-y重组质粒和ptrc99a-s重组质粒；

8、2)分别以步骤1)得到的ptrc99a-cb重组质粒、ptrc99a-gw重组质粒、ptrc99a-t重组质粒、ptrc99a-y重组质粒和ptrc99a-s重组质粒为模板，经引物对扩增，分别得到rbs-mancb基因簇片段、rbs-gmdwcag基因簇片段、rbs-fuct基因片段、rbs-lacy基因片段和rbs-seta基因片段；

9、3)将所述步骤2)得到的rbs-mancb基因簇片段、rbs-gmdwcag基因簇片段、rbs-fuct基因片段、rbs-lacy基因片段和rbs-seta基因片段连接到ptrc99a载体中，得到重组质粒ptrc99a-cbgwfys；

10、4)将所述步骤3)得到的重组质粒ptrc99a-cbgwfys转化到大肠杆菌中，得到大肠杆菌重组菌株；所述大肠杆菌敲除了lacz基因。

11、优选的，所述步骤1)扩增ptrc99a载体的骨架dna使用的引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；

12、扩增mancb基因簇使用的引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；

13、扩增gmdwcag基因簇使用的引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.6所示；

14、扩增fuct基因使用的引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.7所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.8所示；

15、扩增lacy基因使用的引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.9所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.10所示；

16、扩增seta基因使用的引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.11所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.12所示。

17、优选的，所述步骤2)扩增rbs-mancb基因簇片段使用的引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.13所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.14所示；

18、扩增rbs-gmdwcag基因簇片段使用的引物对的上游引物的核苷酸序列如seq idno.15所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.16所示；

19、扩增rbs-fuct基因片段使用的引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.17所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.18所示；

20、扩增rbs-lacy基因片段使用的引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.19所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.20所示；

21、扩增rbs-seta基因片段使用的引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.21所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.22所示。

22、优选的，所述步骤3)扩增ptrc99a载体的线性化片段使用的引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.23所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.24所示。

23、优选的，所述步骤3)连接的体系包括：ptrc99a载体的线性化片段100ng、rbs-mancb基因簇片段100ng、rbs-gmdwcag基因簇片段100ng、rbs-fuct基因片段100ng、rbs-lacy基因片段100ng、rbs-seta基因片段100ng、10×tangobuffer2μl、t4dna连接酶1μl和bsai酶1μl，双蒸水补齐至20μl。

24、优选的，所述连接的条件包括：37℃1min；16℃1min，30个循环；60℃5min。

25、优选的，所述步骤4)大肠杆菌为大肠杆菌c41(de3)。

26、优选的，所述步骤4)重组质粒ptrc99a-cbgwfys与大肠杆菌的体积比为1:100；

27、所述重组质粒ptrc99a-cbgwfys以溶液形式进行转化，浓度为10ng/μl；

28、所述大肠杆菌以菌液形式进行转化，湿菌体含量为20g/l。

29、优选的，所述转化的条件包括：将所述重组质粒ptrc99a-cbgwfys和大肠杆菌在冰上混合，静置20min后，在42℃水浴中热激90s，再迅速置冰上3～5min。

30、本发明的有益效果为：

31、本发明将mancb基因簇、gmdwcag基因簇、fuct基因、lacy基因、seta基因均通过trc启动子控制转录，在该情况下携带有ptrc99a的重组大肠杆菌菌株摇瓶发酵合成2’-fl，可以获得7.85g/l的产量。