一种组织化培养的细胞培育肉制造新方法与流程

本发明属于细胞培育肉，具体是一种组织化培养的细胞培育肉制造新方法。

背景技术：

1、生物培育肉是所有人造肉种类中与传统肉最为接近的，这使它具备很高的商用价值。但目前的细胞培育肉制造过程是通过细胞培养，然后经食品化加工形成的培育肉，这种培育肉从根本上来讲是细胞堆积物，而不是传统肉类食品中的肌肉组织。

2、传统的培育肉制造方法是通过微载体或者支架进行细胞培养以提供巨量的细胞，进而通过组织工程技术对细胞进行塑形生产出生物培育肉。虽然被市场看好，但传统的细胞二维培养方法由于无法真正模拟体内的微环境，无法满足细胞生长发育为块状肉的要求。与传统的二维培养不同，细胞的三维培养能够模拟细胞在体内的情况，使细胞呈现出空间立体生长的状态。然而，天然组织通常具有复杂的结构和组分，所以通过组织工程技术再现天然组织的复杂性仍然是一项重大挑战。

3、在组织工程技术中，3d生物打印已经成为广泛使用的增材制造方法，用于构建人工组织和器官。虽然3d生物打印的发展显现出从物理结构方面构建人工组织的巨大前景，但将其用于实现个性化组织或由细胞自主发育成为块状肉方面仍存在挑战。具体而言，尽管3d生物打印可以将细胞打印到墨水中形成宏观结构，但内部微观层面细胞的增殖仍是以细胞为单位拼凑而不是真正的具有功能性融合状态生物组织，其特点是拼凑的细胞而不是融合的组织，最终结果是形成了一个块状的形态但没有生物组织结构。

技术实现思路

1、针对上述现有技术的不足，本发明提供一种可以培育生物组织结构而不是细胞堆积物的组织化培养的细胞培育肉制造新方法，它突破了当前基于细胞培养、生物反应器工艺和细胞分化形成碎肉的制造体系，形成了全新的细胞培育肉制造技术体系。

2、本发明提供的一种组织化培养的细胞培育肉制造新方法，包括如下步骤：

3、第一步，制备细胞培养支架

4、1)通过食品级材料提取蛋白原液；

5、2)将所述蛋白原液与生物相容材料按一定比例混合进行孵育，得支架浆料；

6、3)将所述支架浆料经3d打印且交联后，得细胞培养支架。

7、第二步，细胞接种

8、制作细胞悬液，然后将细胞悬液加入细胞培养支架中，37℃静置2h，吹打后继续37℃静置2h。

9、第三步，组织化细胞培养

10、细胞培养支架每24h更换新的培养基，直到细胞可以在支架中形成具有膜状组织结构。

11、进一步的，所述蛋白原液与生物相容材料的重量比为1：1。

12、进一步的，所述蛋白原液包括白蛋白、纤连蛋白和粘连蛋白溶液，三者按照85:7.5:7.5的重量比进行混合。

13、优选的，所述食品级材料为鸡蛋。

14、优选的，所述生物相容材料是透明质酸的浓度为5-10％的明胶水溶液。

15、进一步的，所述3d打印的条件为：挤出流速3.00-6.00mm3/s，打印速度4.00-5.00mm/s，线间距0.2-0.6mm。

16、进一步的，所述交联包括利用戊二醛水溶液对打印后支架进行交联，交联反应时间为5-15min。优选的，戊二醛水溶液得浓度为0.25％。

17、进一步的，上述第二步中制作细胞悬液方法如下：对培养的细胞进行传代，先吸除培养板中的基础培养基，用37℃预热的含有双抗的pbs进行清洗，清洗过程中吹打的力度可以适当加大，以便将死细胞洗掉，再向培养板内加入0.25％的胰蛋白酶，加入量为能够覆盖培养板底部为宜，37.0℃消化2min后把培养板放置显微镜下观察，当细胞间质回缩、细胞变圆且细胞间隙增大后，加入3倍体积的基础培养基或者1倍体积的胎牛血清终止消化，用10ml移液枪反复吹打培养板底壁，以便将细胞脱离培养板，待细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液，将细胞悬液移入离心管中1000rpm离心5min，然后吸除上清液后重新加入培养基，以便除去胰蛋白酶，重新加入培养基重悬细胞。

18、第二步中的所述细胞采用成肌细胞、肌肉干细胞、肌卫星细胞或肌肉前体细胞，所述细胞来源与猪、鸡、牛或羊。

19、本发明的有益效果：

20、本发明方法制造的培育肉是一种生物组织结构而不是细胞堆积物，培养过程中可以形成膜状类组织结构；它突破了当前基于细胞培养、生物反应器工艺和细胞分化形成碎肉的制造体系，形成了全新的细胞培育肉制造技术体系。

21、利用本发明的细胞培养支架可以直接培养肌肉组织，从食品角度来讲，本发明制造的是真正意义上的肌肉，而不是细胞的堆积物。本发明的细胞培养支架突破了市面上细胞培养支架高成本(本发明成本低至0.1元/g)、低密度及不可食用的难题，并且可以形成膜状类组织结构。

22、利用本发明细胞培养支架可进行多种不同类型的细胞培养，并且利用3d打印机制造的多层及三维立体结构，在体外重现细胞的体内环境，有利于细胞在体外进行三维生长，使肌肉干细胞等细胞可呈现空间立体生长的状态，进而有助于其定向融合形成肌管细胞；支持细胞粘附、三维生长，增殖呈现出空间立体生长的状态，可高效促进肌肉干细胞等细胞的大规模高效扩增培养，1mm2面积内可供600-800多个细胞进行生长或增殖。此外，本发明开发的细胞培养支架能使“膜”状细胞组织的形成，可用于类组织培养的细胞培养肉的制造。此外，还突破了细胞培养条件的限制，在常规细胞培养环境中，可实现细胞在任何容器以任何形式进行培养。

技术特征：

1.一种组织化培养的细胞培育肉制造新方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种组织化培养的细胞培育肉制造新方法，其特征在于，所述蛋白原液与生物相容材料的重量比为1：1。

3.根据权利要求1所述的一种组织化培养的细胞培育肉制造新方法，其特征在于，所述蛋白原液包括白蛋白、纤连蛋白和粘连蛋白溶液，三者按照85:7.5:7.5的重量比进行混合。

4.根据权利要求1所述的一种组织化培养的细胞培育肉制造新方法，其特征在于，所述食品级材料为鸡蛋。

5.根据权利要求1所述的一种组织化培养的细胞培育肉制造新方法，其特征在于，所述生物相容材料是透明质酸的浓度为5-10％的明胶水溶液。

6.根据权利要求1所述的一种组织化培养的细胞培育肉制造新方法，其特征在于，所述3d打印的条件为：挤出流速3.00-6.00mm3/s，打印速度4.00-5.00mm/s，线间距0.2-0.6mm。

7.根据权利要求1所述的一种组织化培养的细胞培育肉制造新方法，其特征在于，所述交联包括利用戊二醛水溶液对打印后支架进行交联，交联反应时间为5-15min。

8.根据权利要求1所述的一种组织化培养的细胞培育肉制造新方法，其特征在于，戊二醛水溶液得浓度为0.25％。

9.根据权利要求1所述的一种组织化培养的细胞培育肉制造新方法，其特征在于，第二步中制作细胞悬液方法如下：对培养的细胞进行传代，先吸除培养板中的基础培养基，用37℃预热的含有双抗的pbs进行清洗，清洗过程中吹打的力度可以适当加大，以便将死细胞洗掉，再向培养板内加入0.25％的胰蛋白酶，加入量为能够覆盖培养板底部为宜，37.0℃消化2min后把培养板放置显微镜下观察，当细胞间质回缩、细胞变圆且细胞间隙增大后，加入3倍体积的基础培养基或者1倍体积的胎牛血清终止消化，用10ml移液枪反复吹打培养板底壁，以便将细胞脱离培养板，待细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液，将细胞悬液移入离心管中1000rpm离心5min，然后吸除上清液后重新加入培养基，以便除去胰蛋白酶，重新加入培养基重悬细胞。

10.根据权利要求1所述的一种组织化培养的细胞培育肉制造新方法，其特征在于，第二步中的所述细胞采用成肌细胞、肌肉干细胞、肌卫星细胞或肌肉前体细胞，所述细胞来源与猪、鸡、牛或羊。

技术总结
本发明提供一种组织化培养的细胞培育肉制造新方法，包括如下步骤：第一步，制备细胞培养支架，通过食品级材料提取蛋白原液；将所述蛋白原液与生物相容材料按一定比例混合进行孵育，得支架浆料；将所述支架浆料经3D打印且交联后，得细胞培养支架。第二步，细胞接种；第三步，组织化细胞培养，细胞培养支架每24h更换新的培养基，直到细胞可以在支架中形成具有膜状组织结构。本发明方法制造的培育肉是一种生物组织结构而不是细胞堆积物，培养过程中可以形成膜状类组织结构；它突破了当前基于细胞培养、生物反应器工艺和细胞分化形成碎肉的制造体系，形成了全新的细胞培育肉制造技术体系。

技术研发人员：王守伟,祁宇,郭翔,杨峰,李莹莹,赵鹏飞,胡海娟,刘文婷,李雨爽
受保护的技术使用者：中国肉类食品综合研究中心
技术研发日：
技术公布日：2024/2/21