一种产植酸酶的副干酪乳杆菌突变菌株及其应用

本发明涉及微生物菌种的改造及其应用的，具体涉及一种产植酸酶的乳杆菌突变菌株及其应用的。

背景技术：

1、植酸酶是能将植酸(肌醇六磷酸)或植酸盐水解为肌醇、磷酸或磷酸盐的一类酶的总称。植酸具有强大的络合力，通常与钙、铁、磷等矿物质元素结合，形成不溶性盐类，还可以络合蛋白质，减少它们与消化酶的接触及抑制消化酶的活性，动物饲粮中的磷主要以植酸的形式存在，然而过高的植酸会降低饲料的转化率，限制了饲料中营养物质利用。由于单胃动物不能够分泌植酸酶，因此饲料中必须外源添加足量的植酸酶，而细菌是植酸酶的一个重要来源，其中绝大多数乳酸菌对动物和人无毒、无害，具有调节免疫、修复肠道菌群、合成抗菌物质的益生功能，可广泛用于工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域。

2、现在生活节奏较快，人们通常都会选择见效速度较快的抗生素来提高畜产品的免疫力，但是抗生素类的频繁使用使得动物体内的消化道环境发生的变化，自我调节能力差并且微生物菌群失衡，长时间使用只会出现感染和更多潜在危害。

3、目前，国内外大量研究已确证在家禽的饲粮中特别是低有效磷饲粮添加植酸酶能够提高生产效益。由于乳酸菌及其制品能够调整肠道微生态平衡、提高饲料的利用率及增强机体免疫力等，可代替抗生素类药物引入养殖业，副干酪乳杆菌是乳酸杆菌属的种群之一，常应用于食品、保健品、药品等生产中，且近年来被农业部允许应用于动物养殖中。目前关于微生物产植酸酶报道虽多，如曲霉、芽孢杆菌等，但是目前关于副干酪乳杆菌产植酸酶及其应用研究鲜有报道，其主要原因是乳酸菌自身产值酸酶活力低。

技术实现思路

1、针对现有乳酸菌由于自身原因导致产植酸酶活力低的技术问题，本发明旨在于提供了一种高产植酸酶的副干酪乳杆菌突变菌株及其应用，通过常压室温等离子体诱变方法筛选获得一株植酸酶产量得到显著提高的突变菌株，该菌株生产周期短、易培养，产植酸酶，在ph＝3条件下存活率为42.47％，在胆盐浓度0.1％时js5-1存活率为71.14％，在模拟肠液和胃液中，存活率分别为67.8％和7.6％，其活菌数均在1×106cfu/ml以上，达到发挥益生作用的最小活菌数要求，自聚集力为10.09±0.72，可促进菌株在肠道的定殖，在培养基中连续传代培养7代，每代植酸酶活性保持稳定，具有较好的遗传稳定性，有利于副干酪乳杆菌在益生菌领域中的广泛应用。

2、为了达到以上技术效果，本发明通过如下技术方案实现。

3、本发明提供一种突变体菌株副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)js5-1。

4、本发明提供的副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)js5-1是通过常压室温等离子体诱变方法筛选获得，经16sr dna序列系统发育分析，菌株副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)js5-1属于lactobacillus属。通过对该菌株基因测序，所得序列通过ez biocloud网站进行比对分析，菌株js5-1的16sr dna序列与副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)jcm1171(lc065035)的同源性最高，相似度为98.87％。选取同源性较高的序列利用meag11，以neighbor-joining法(1000bootstrap)构建系统发育进化树，菌株(lactobacillusparacasei)js5-1与副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)atcc25302(acgy01000162)亲缘关系最近，经过系列多相分类鉴定可确定该菌株(lactobacillusparacasei)js5-1为副干酪乳杆菌lactobacillus新菌种，具有新菌种典型性的特点。

5、本发明提供的副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)js5-1经过上述本领域熟知公认的菌种系统分子水平鉴定，结合根据形态学鉴定、生理生化特征等多相分类系统鉴定分析，本发明涉及副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)js5-1与该属同源性最近的标准模式菌株存在多项不同，证实该菌株js5-1属于lactobacillus属的新菌种，将其命名为副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)js5-1，该菌株已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏日期：2023年10月26日，保藏号为cgmcc no.28776。

6、本发明中，副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)js5-1的基因序列如seq idno:1所示。

7、本发明中，副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)js5-1的培养基为：酪蛋白胨10g/l、牛肉浸取物4g/l、酵母提取物2g/l、葡萄糖10g/l、乙酸钠5g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、吐温-80 1g/l、半胱氨酸0.05％w/v、植酸钠0.65g/l、mops 0.1mol/l、硫酸镁0.58g/l、硫酸锰0.25g/l、碳酸钙20g/l和琼脂15g/l，调ph为5.0～5.5。

8、同时本发明提供的一种常压室温等离子体诱变菌株副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)js5-1的培养方法，具体包括如下步骤：

9、将副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)js5-1接种于5ml mrs肉汤中，37℃静态培养24h；将1％(v/v)的上述培养物转移到10ml mrs培养液中，37℃培养24h后离心收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤两次，得5×106cfu/ml菌悬液；取10μl菌悬液，置于artp诱变系统样品处理室，测定诱变菌株致死率，确定最佳诱变时间，筛选获得植酸酶活性提高且遗传稳定的副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)js5-1诱变菌株。

10、进一步地，本发明一种常压室温等离子体诱变菌株副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)js5-1的培养方法中，所述artp的工作参数为：射频功率输入为100w；工作气体纯氦的流量为10l/min，处理时间0～200s，所述artp的最佳诱变时间150s。

11、本发明提供副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)js5-1在益生菌领域中的应用。

12、依据其副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)js5-1产植酸酶、耐酸、耐胆盐、耐肠胃液及抑菌特性可应用于人与动物的益生菌补充、食品发酵、饲料发酵等领域。

13、通过以上技术方案，本发明得到以下技术效果：

14、本发明旨在于提供一种通过常压室温等离子体诱变方法筛选获得植酸酶产量得到显著提高的副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)js5-1，通过利用该菌种副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)js5-1生产周期短、易培养，产植酸酶，在ph＝3条件下存活率为42.47％，在胆盐浓度0.1％时js5-1存活率为71.14％，在模拟肠液和胃液中，存活率分别为67.8％和7.6％，其活菌数均在1×106cfu/ml以上，达到发挥益生作用的最小活菌数要求，自聚集力为10.09±0.72，可促进菌株在肠道的定殖，且对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌均有抑制作用，与常见的副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)相比较获得显著突出的技术效果，对于微生物菌种应用技术领域具有广泛的应用价值。