一种甲酸脱氢酶突变体及其在制备还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸中的应用的制作方法

本发明涉及酶催化，具体领域为一种甲酸脱氢酶突变体及其在制备还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸中的应用。

背景技术：

1、nadh的再生循环方法是利用nad还原为nadh来实现的。目前将nad还原为nadh的主要酶促方法有醇脱氢酶、甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶等，醇脱氢酶和乙醇。甲酸铵工艺是将甲酸、碱金属和甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase，fdh)一起孵育并去除大部分形成的碳酸盐，酶促制备还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其磷酸盐，并用到了至少一种碱金属甲酸盐，最终消除形成的碱金属碳酸盐。醇脱氢酶方案需要使用过量的乙醇，并不断去除产生的挥发性乙醛。最大弊端是nadh转化不完全，且在反应中产生有毒的乙醛。相比较而言，甲酸脱氢酶反应体系中只产生一种副产物－二氧化碳，对酶的活性无不利影响，对工业制造有更大的吸引力。

2、现有的甲酸铵工艺还存在一些自身的缺陷，甲酸脱氢酶来源范围较小，主要集中于不耐热微生物，导致目前主流使用的fdh热稳定性较差，最适反应温度多在30℃左右，而在45℃～60℃之间迅速失活。

3、因此，本发明试图寻找一种甲酸脱氢酶突变体来解决上述问题，既可以让甲酸脱氢酶耐受高温同时保持高酶活，同时又可实现nadh的稳定再生进而扩大应用范围。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种甲酸脱氢酶突变体及其在制备还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸中的应用。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种甲酸脱氢酶突变体，其氨基酸序列如seq id no：3所示。

4、本发明的甲酸脱氢酶突变体可用于备还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，其使用方法为：分别称取甲酸铵、nad至烧瓶中，加纯水，在45℃水浴中搅拌溶解并使用氢氧化钠调节ph至8.5，加入甲酸脱氢酶突变体的粗酶液进行反应，并用氢氧化钠维持ph在8.5。

5、其中，所述粗酶液的制备方法包括以下步骤：

6、(1)通过引物拼接的方法，将seq id no：3所示蛋白的对应编码多核苷酸序列进行组装，并克隆到原核表达载体，以实现在大肠杆菌中的高表达；

7、(2)采用摇瓶发酵或者分批补料发酵

8、①摇瓶发酵

9、挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于3ml高压灭菌后的培养基a中，30℃，250rpm过夜培养；

10、次日取1l三角瓶，按1：100的接种比例接入到250ml高压灭菌后的培养基b中，于37℃中培养至菌体od 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时；加iptg至终浓度0.1mm，并于25℃，180rpm继续培养12小时；

11、培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体；然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗1次，收集菌体，-70℃保存；同时取少量菌体进行sds-page检测；

12、②分批补料发酵

13、分批补料发酵在计算机控制的生物反应器中进行，将含有表达载体的大肠杆菌单菌落制备200ml培养物，当培养物为od2.0时接入所述生物反应器；在整个发酵过程中，温度保持37℃，发酵过程中溶解氧浓度由搅拌速率和通气供应级联自动控制在30％，而培养基的ph值由50％v/v正磷酸和30％v/v氨水维持在7.0；发酵过程中，当出现溶氧回升时，开始补料，补料溶液含有9％w/v蛋白胨、9％w/v酵母提取物、14％w/v甘油；当od600为50.0时，控制温度为25℃，并用0.1mm iptg诱导表达16小时，离心收菌体-25℃保存。

14、所述培养基a为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氢二钠3.55g/l，磷酸二氢钾3.4g/l，氯化铵2.68g/l，硫酸钠0.71g/l，七水硫酸镁0.493g/l，六水氯化铁0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.8g/l，添加卡那霉素至50mg/l。

15、其中，所述培养基b为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氢二钠3.55g/l，磷酸二氢钾3.4g/l，氯化铵2.68g/l，硫酸钠0.71g/l，七水硫酸镁0.493g/l，六水氯化铁0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.3g/l，添加卡那霉素至50mg/l。

16、其中，分批补料发酵所用的培养基为：酵母抽提物24g/l，蛋白胨12g/l，0.4％w/v葡萄糖，2.31g/l磷酸二氢酶和12.54g/l磷酸氢二钾，ph 7.0。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

18、与野生型甲酸脱氢酶相比，本发明的甲酸脱氢酶突变体的酶活更高，并且在特定的反应条件下(45℃，ph8.5)具有更快的反应速度和更高的底物转化率，更少的底物浪费，有利于产物的高效分离。

19、本发明的甲酸脱氢酶应用于较高ph和较高温度下的nadh的制备有较大优势，甲酸脱氢反应是不可逆反应，并只产生一种副产物二氧化碳，可直接从产物中分离出去；由于反应完成后无碳酸盐产生和底物残余，使得纯化成本变低；反应时间更短，也有利于减少能耗。

技术特征：

1.一种甲酸脱氢酶突变体，其特征在于：其氨基酸序列如seq id no：3所示。

2.权利要求1所述甲酸脱氢酶突变体在制备还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸中的应用。

3.根据权利要求2所述甲酸脱氢酶突变体在制备还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸中的应用，其特征在于：分别称取甲酸铵、nad至烧瓶中，加纯水，在45℃水浴中搅拌溶解并使用氢氧化钠调节ph至8.5，加入甲酸脱氢酶突变体的粗酶液进行反应，并用氢氧化钠维持ph在8.5。

4.根据权利要求3所述甲酸脱氢酶突变体在制备还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸中的应用，其特征在于：所述粗酶液的制备方法包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述甲酸脱氢酶突变体在制备还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸中的应用，其特征在于：粗酶液制备方法中，分批补料发酵所用的培养基为：酵母抽提物24g/l，蛋白胨12g/l，0.4％w/v葡萄糖，2.31g/l磷酸二氢酶和12.54g/l磷酸氢二钾，ph7.0。

技术总结
本发明涉及酶催化技术领域，尤其是一种甲酸脱氢酶突变体及其在制备还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸中的应用，该甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，可用于制备还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。与野生型甲酸脱氢酶相比，本发明的甲酸脱氢酶突变体的酶活更高，并且在特定的反应条件下(45℃，pH8.5)具有更快的反应速度和更高的底物转化率，更少的底物浪费，有利于产物的高效分离。

技术研发人员：丁雪峰,钱明,李佳松
受保护的技术使用者：南京诺云生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/27