突变型MAD7蛋白的制作方法

本发明涉及突变型mad7蛋白等。

背景技术：

1、转基因动物目前应用于医学和生物学等各个研究领域，以阐明生物的基本机制或作为人类疾病的模型。作为快速制造转基因动物的手段，zfn(锌指核酸酶(zinc-fingernucleases)、talen(转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-likeeffector nucleases)、以及crispr/cas系统(成簇规律间隔短回文重复关联系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeat-asociated system))等利用人工限制酶的系统备受关注。这些新技术被称为基因组编辑，在不利用胚胎干细胞(es细胞)或诱导性多能干细胞(ips细胞)的情况下使得改变广泛的生物基因组成为可能。

2、作为cas蛋白，cas9蛋白应用广泛，但mad7蛋白等新型cas蛋白的使用也在扩大。另外，为了提高mad7蛋白质的活性，也进行了导入各种突变的尝试(专利文献1)。

3、现有技术文献：

4、专利文献

5、专利文献1：国际公开第2020/086475号

技术实现思路

1、发明要解决的课题

2、本发明的课题是提供对靶点具有更高切割活性的突变型mad7蛋白。

3、解决课题的方法

4、本发明人鉴于上述课题进行了深入研究，结果发现，如果序列号1所示的氨基酸序列a包含突变而得到的氨基酸序列b，并且所述氨基酸序列b是包含所述氨基酸序列a中的k169和d529的氨基酸取代突变的突变型mad7蛋白质，则可以解决上述课题。本发明人基于该见解进一步进行了研究，结果完成了本发明。即，本发明包括以下的方式。

5、mad7蛋白的氨基酸序列(序列号1)

6、

7、项1：一种突变型mad7蛋白，其包含由序列号1所示的氨基酸序列a突变而得到的氨基酸序列b，且所述氨基酸序列b包含所述氨基酸序列a中的k169和d529的氨基酸取代突变。

8、项2：根据项1所述的突变型mad7蛋白，其中所述氨基酸序列b包含下述(a1)、(a2)或(a3)的氨基酸序列：

9、(a1)在序列号1的氨基酸序列中，含有k169和d529的氨基酸取代突变的氨基酸序列；

10、(a2)在序列号1的氨基酸序列中，一个或数个氨基酸具有缺失、插入、取代和/或添加，且含有上述(a1)的氨基酸取代突变的氨基酸序列；

11、(a3)在序列号1的氨基酸序列中，相对于序列号1的氨基酸序列具有70％以上的同一性，且含有上述(a1)的氨基酸取代突变的氨基酸序列。

12、项3：根据项1或2所述的突变型mad7蛋白，其中在所述氨基酸取代突变中，k169突变后的氨基酸为赖氨酸以外的碱性氨基酸，d529突变后的氨基酸为碱性氨基酸。

13、项4：根据项1～3中任一项所述的突变型mad7蛋白，其中在所述氨基酸取代突变中，k169突变后的氨基酸为精氨酸，且d529突变后的氨基酸为精氨酸。

14、项5：根据项1～4中任一项所述的突变型mad7蛋白，其中所述氨基酸序列b包含所述氨基酸序列a中的y1086的氨基酸取代突变。

15、项6：根据项5所述的突变型mad7蛋白，其中在所述氨基酸取代突变中，y1086突变后的氨基酸为酪氨酸以外的芳香族氨基酸。

16、项7：根据项5或6所述的突变型mad7蛋白，其中在所述氨基酸取代突变中，y1086突变后的氨基酸为苯丙氨酸。

17、项8：根据项1～7中任一项所述的突变型mad7蛋白，其中所述氨基酸序列b包含至少一种选自所述氨基酸序列a中的k970和e1227的氨基酸的氨基酸取代突变。

18、项9：根据项8所述的突变型mad7蛋白，其中所述氨基酸取代突变中，k970突变后的氨基酸为亲水性中性氨基酸，和/或e1227突变后的氨基酸为碱性氨基酸。

19、项10：根据项8或9所述的突变型mad7蛋白，其中在所述氨基酸取代突变中，k970突变后的氨基酸为天冬酰胺，和/或e1227突变后的氨基酸为赖氨酸。

20、项11：根据项1～10中任一项所述的突变型mad7蛋白，其中所述氨基酸序列b包含至少一种选自所述氨基酸序列a中的m961、k1098、f1198、q1230、i1230和n1250的氨基酸的氨基酸取代突变。

21、项12：根据项1～11中任一项所述的突变型mad7蛋白，其中所述氨基酸序列b包含至少一种选自所述氨基酸序列a中的c892、y907、i922、y966、s1000、t1014、k1040、l1056、i1065、k1067、t1083、f1163、d1200、k1236、d1238、f1241、s1242和k1247的氨基酸的氨基酸取代突变。

22、项13：根据项1～12中任一项所述的突变型mad7蛋白，其中所述氨基酸序列b包含下述(b1)、(b2)或(b3)的氨基酸序列：

23、(b1)序列号2的氨基酸序列；

24、(b2)在序列号2的氨基酸序列中，缺失、插入、取代和/或添加了一个或数个氨基酸，且序列号2的氨基酸序列中的第169位和第529位氨基酸是保守的氨基酸序列；

25、(b3)与序列号2的氨基酸序列具有70％以上的同一性，且序列号2的氨基酸序列中的第169和第529位氨基酸是保守的氨基酸序列。

26、项14：根据项13所述的突变型mad7蛋白，其中在所述(b2)或(b3)中，序列号2的氨基酸序列中的第1086位氨基酸是保守的。

27、项15：根据项13或14所述的突变型mad7蛋白，其中在所述(b2)或(b3)中，序列号2的氨基酸序列中的第970位和/或第1227位氨基酸是保守的。

28、项16：根据项1～12中任一项所述的突变型mad7蛋白，其中所述氨基酸序列b包含下述(c1)、(c2)或(c3)的氨基酸序列：

29、(c1)序列号3的氨基酸序列；

30、(c2)在序列号3的氨基酸序列中，缺失、插入、取代和/或添加了一个或数个氨基酸，且序列号3的氨基酸序列中的第169位和第529位氨基酸是保守的氨基酸序列；

31、(c3)与序列号3的氨基酸序列具有70％以上的同一性，且序列号3的氨基酸序列中的第169和第529位氨基酸是保守的氨基酸序列。

32、项17：根据项13或14所述的突变型mad7蛋白，其中在所述(c2)或(c3)中，进一步地，序列号3的氨基酸序列中的第1086位氨基酸是保守的。

33、项18：根据项16或17所述的突变型mad7蛋白，其中在所述(c2)或(c3)中，进一步地，序列号为3的氨基酸序列中的第970位和/或第1227位氨基酸是保守的。

34、项19：根据项1～18中任一项所述的突变型mad7蛋白，其包含所述氨基酸序列b和核定位信号序列。

35、项20：一种多肽的组合，其包含项1～18中任一项所述的突变型mad7蛋白的第1分割片段和第2分割片段，

36、所述第1分割片段和所述第2分割片段分别是由选自下述(1)～(10)和(11)的氨基酸序列构成的多肽：

37、(1)第1分割片段：与序列号1的第1～182位氨基酸序列对应的氨基酸序列，第2分割片段：与序列号1的第183～1263位氨基酸序列对应的氨基酸序列；

38、(2)第1分割片段：与序列号1的第1～273位氨基酸序列对应的氨基酸序列，第2分割片段：与序列号1的第274～1263位氨基酸序列对应的氨基酸序列；

39、(3)第1分割片段：与序列号1的第1～292位氨基酸序列对应的氨基酸序列，第2分割片段：与序列号1的第293～1263位氨基酸序列对应的氨基酸序列；

40、(4)第1分割片段：与序列号1的第1～377位氨基酸序列对应的氨基酸序列，第2分割片段：与序列号1的第378～1263位氨基酸序列对应的氨基酸序列；

41、(5)第1分割片段：与序列号1的第1～511位氨基酸序列对应的氨基酸序列，第2分割片段：与序列号1的第512～1263位氨基酸序列对应的氨基酸序列；

42、(6)第1分割片段：与序列号1的第1～538位氨基酸序列对应的氨基酸序列，第2分割片段：与序列号1的第539～1263位氨基酸序列对应的氨基酸序列；

43、(7)第1分割片段：与序列号1的第1～567位氨基酸序列对应的氨基酸序列，第2分割片段：与序列号1的第568～1263位氨基酸序列对应的氨基酸序列；

44、(8)第1分割片段：与序列号1的第1～755位氨基酸序列对应的氨基酸序列，第2分割片段：与序列号1的第756～1263位氨基酸序列对应的氨基酸序列；

45、(9)第1分割片段：与序列号1的第1～832位氨基酸序列对应的氨基酸序列，第2分割片段：与序列号1的第833～1263位氨基酸序列对应的氨基酸序列；

46、(10)第1分割片段：与序列号1的第1～854位氨基酸序列对应的氨基酸序列，第2分割片段：与序列号1的第855～1263位氨基酸序列对应的氨基酸序列；

47、(11)第1分割片段：具有与序列号1的第1～49位和512～1263氨基酸序列对应的氨基酸序列，且与序列号1的第513位对应的氨基酸y被s取代，第2分割片段：与序列号1的第50～511位氨基酸序列对应的氨基酸序列。

48、项21：一种多核苷酸，其包含项1～19中任一项所述的突变型mad7蛋白和/或项20的多肽的编码序列。

49、项22：一种载体，其包含项21所述的多核苷酸。

50、项23：一种组合物，其包含项1～19中任一项所述的突变型mad7蛋白、项20所述的多肽的组合、项21所述的多核苷酸和/或项22所述的载体、以及针对靶点的导向rna。

51、项24：一种细胞，其包含项1～19中任一项所述的突变型mad7蛋白、项20所述的多肽的组合、项21所述的多核苷酸和/或项22所述的载体。

52、项25：一种基因组编辑方法，其包括将项1～19中任一项所述的突变型mad7蛋白、项20所述的多肽的组合、项21所述的多核苷酸和/或项22所述的载体导入细胞或非人生物。

53、项26：根据项25所述的基因组编辑方法，还包括将靶点的导向rna导入所述细胞或非人生物。

54、项27：一种靶点已被基因组编辑的细胞或生物的制造方法，

55、其包括将项1～19中任一项所述的突变型mad7蛋白、项20所述的多肽的组合、项21所述的多核苷酸和/或项22所述的载体和针对所述靶点的导向rna导入细胞或非人生物。

56、项28：通过项27的制造方法得到的细胞或生物。

57、项29：一种实验用基因组编辑用组合物，其包含项1至19中任一项所述的突变型mad7蛋白、项20所述的多肽的组合、项21所述的多核苷酸、项22所述的载体和/或项24所述的细胞。

58、项30：一种农用基因组编辑用组合物，其包含项1～19中任一项所述的突变型mad7蛋白、项20所述的多肽的组合、项21所述的多核苷酸、项22所述的载体和/或项24所述的细胞。

59、项31：一种医用基因组编辑用组合物，其包含项1～19中任一项所述的突变型mad7蛋白、项20所述的多肽的组合、项21所述的多核苷酸、项22所述的载体和/或项24所述的细胞。

60、项32：一种畜产用基因组编辑用组合物，其包含项1～19中任一项所述的突变型mad7蛋白、项20所述的多肽的组合、项21所述的多核苷酸、项22所述的载体和/或项24所述的细胞。

61、项33：一种水产用基因组编辑用组合物，其包含项1～19中任一项所述的突变型mad7蛋白、项20所述的多肽的组合、项21所述的多核苷酸、项22所述的载体和/或项24所述的细胞。

62、项34：一种工业用基因组编辑用组合物，其包含项1～19中任一项所述的突变型mad7蛋白、项20所述的多肽的组合、项21所述的多核苷酸、项22所述的载体和/或项24所述的细胞。

63、发明的效果

64、根据本发明，可以提供对靶点具有更高切割活性的突变型mad7蛋白。另外，由此，与使用野生型mad7蛋白相比，能够以更高的效率进行基因组编辑。