测量多重RNA表达的方法和系统

本发明涉及下一代测序。更具体地，本发明涉及用于测量多重rna表达的方法和系统。

背景技术：

1、临床上广泛将下一代测序(ngs)技术用于许多分子诊断测定，而不是rna表达。然而，目前还没有使用ngs进行多重rna定量的可靠方法。

2、目前可用的通过rna测序的rna表达具有以下问题：i)临床相关基因定量效率低；ii)测量低表达水平但临床上重要的基因的准确性低，诸如alk—精准医学中最成功的靶标；iii)成本高，因为它只允许全基因组分析，而其中绝大多数基因组与临床无关；iv)不适用于最容易获得的临床样品，诸如ffpe肿瘤组织。除了主流ngs工作流程外，还需要通常与低多重能力(例如，rt-qpcr或数字pcr)相关的rna表达分析中的其他非ngs方法以及另外的样品和工作流程(例如，rna-scope和nanostring)。

3、使用免疫检查点抑制剂(ici)的革命性癌症免疫疗法可能在多种癌症中带来持久的反应。从ici疗法受益的癌症患者为约20-30％，但是为了找到这些癌症患者目前所用的诊断方法是不理想的。

4、研究人员花费很大努力来识别ici的预测标志物，包括pd-l1表达，肿瘤浸润淋巴细胞(til)，尤其是cd8+t细胞5。较高的orr与pd-l1的高表达相关，pd-l1肿瘤比例评分(tps)为1％或以上的患者和tps为50％或以上的患者的orr分别为27％和39％6。目前，四种pd-l1ihc测定7，8(22c3、28-8、sp142和sp263)被fda批准作为nsclc中不同ici(分别为帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、阿替利珠单抗和度伐利尤单抗)的伴随或补充诊断测定。然而，决定高pd-l1表达的临界值(cutoffs)在不同的研究中有所不同7(1％、5％、10％或50％ pd-l1阳性细胞)。此外，目前的ihc测定识别pd-l1的不同表位。ventana sp142和sp263靶向pd-l1的胞浆域，而22c3和28-8克隆是针对细胞外结构域的表位产生的9，这可能解释了sp142/sp263和22c3/28-8之间的不一致8。因此，用于ici响应预测的这种半定量方法并不完善，凸显了开发更精确的pd-l1定量方法的必要性。

5、鉴于上述情况，仍然需要开发精确并快速地检测rna表达的新方法。此外，还需要识别ici的预测标志物，这对于精准医学至关重要。

技术实现思路

1、本发明的一个实施方案涉及一种通过同时富集靶序列和相应的rna并计算同一靶序列的rna与dna比值来测量样品中靶序列的rna表达水平的方法，包括以下步骤：

2、(a)将rna反向转录为互补dna(cdna)，得到cdna和基因组dna的混合物；

3、(b)将通用测序衔接子连接到步骤(a)中的gdna和cdna末端；

4、(c)进行第一聚合酶链反应过程以产生包括互补序列的单链引物延伸产物，其中互补序列与gdna、cdna或其组合上的靶序列互补并且与通用测序衔接子互补；

5、(d)进行第二聚合酶链反应过程以扩增单链引物延伸产物；以及

6、(e)执行下一代测序过程并计算同一靶序列的cdna测序读数与gdna测序读数的相对比值，即，rna与dna比值，

7、其中，该靶序列选自基因序列、基因外显子及其组合的组。

8、本发明的一个实施方案涉及一种治疗对象的癌症的方法，该方法包含以下步骤：通过使用本文提供的测量rna表达水平的方法测量靶序列的rna表达水平，并将免疫检查点抑制剂应用于对象。

9、本发明的另一个实施方案涉及一种试剂盒，其用于实施如本文所述的通过同时富集靶dna和相应的rna并计算同一靶序列的rna与dna比值来测量样品中靶序列的rna表达水平的方法，该试剂盒包括：

10、(a)用于将rna转录为互补dna(cdna)的逆转录酶；

11、(b)将被连接到样品中gdna和cdna的末端的通用测序衔接子；

12、(c)在相对于cdna或gdna上的靶序列为3'的位置与cdna和gdna序列结合的第一引物；以及

13、(d)在第一引物和cdna或gdna上的靶序列之间的位置与靶序列结合的第二引物。

技术特征：

1.一种通过同时富集靶序列和相应的rna并计算同一靶序列的rna与dna比值来测量样品中靶序列的rna表达水平的方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一聚合酶链反应过程包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述第二聚合酶链反应过程包括在所述第一引物和cdna或gdna上的靶序列之间的位置将第二引物结合至靶序列。

4.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤(i)至步骤(iii)重复约1个循环至约100个循环。

5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述第二引物用于引发和富集gdna和cdna。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品选自由福尔马林固定石蜡包埋组织、通过手术活检或针吸收集的新鲜组织、血液、尿液、腹水、胸腔积液、脑脊液、胰腺囊液及其组合组成的组。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法用于定量选自由免疫微环境相关的基因、致癌基因、肿瘤抑制基因、管家基因和其他疾病相关基因组成的组中的靶序列的表达。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，总核酸在不去除基因组dna的情况下用于执行步骤(a)中的逆转录。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一引物具有选自由seq id no.1-379以及与seq id no.1-379中的任一个具有至少约80％的相似性的其类似物组成的组的序列。

10.根据权利要求3所述的方法，其中，所述第二引物具有选自由seq id no.380-758以及与seq id no.380-758中的任一个具有至少约80％的相似性的其类似物组成的组的序列。

11.一种治疗对象的癌症的方法，包括以下步骤：

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述对象具有cd274的高表达和gzma的低表达。

13.根据权利要求11所述的方法，其中，所述对象在单个外显子水平上具有cd274的高表达。

14.根据权利要求11所述的方法，其中，所述癌症为非小细胞肺癌。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述非小细胞肺癌选自由腺癌、鳞状细胞癌、大细胞肺癌和其组合组成的组。

16.根据权利要求11所述的方法，其中，所述免疫检查点抑制剂选自由pd-1抑制剂、pd-l1抑制剂及其组合组成的组。

17.根据权利要求11所述的方法，其中，所述免疫检查点抑制剂选自由帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、阿替利珠单抗、度伐利尤单抗及其组合组成的组。

18.一种试剂盒，其用于实施根据权利要求1所述的通过同时富集靶dna和相应的rna并计算同一靶序列的rna与dna比值来测量样品中靶序列的rna表达水平的方法，所述试剂盒包括：

19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中，所述第一引物具有选自由seq id no.1-379和与seq id no.1-379中的任一个具有至少约80％的相似性的其类似物组成的组的序列。

20.根据权利要求18所述的试剂盒，其中，所述第二引物具有选自由seq id no.380-758和与seq id no.380-758中的任一个具有至少约80％的相似性的其类似物组成的组的序列。

技术总结
一种通过同时富集靶序列和相应的RNA并计算同一靶序列的RNA与DNA比值来测量样品中靶序列的RNA表达水平的方法。一种治疗癌症的方法包括使用测量靶序列的RNA表达水平的方法的步骤。一种试剂盒包括用于执行测量靶序列RNA表达水平的方法的组分。

技术研发人员：郑宗立,卢晨雨
受保护的技术使用者：香港城市大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15