本公开提供了包含在核酸文库制备工作流程中用于移除脱氨基碱基的试剂的组合物，以及用于使用该试剂的方法。本文所述的组合物和方法减少了核酸测序工作流程中的碱基识别误差，诸如c:g到t:a转换。
背景技术：
1、多核苷酸测序技术在生物医学研究和保健环境中有应用。经改善的多核苷酸方法需要增强的表面化学、支持物上的多核苷酸扩增和碱基识别。目前，这些要素在现有测序技术中产生障碍，导致通量方面的限制和不良信噪比，并且最终导致与多核苷酸测序相关联的增加的成本。
2、需要带有经改善的表面化学、支持物上的扩增和碱基识别的新的多核苷酸测序方法。本公开提供了通过改善碱基识别并随后提高测序质量来改善多核苷酸测序的方法和组合物。
技术实现思路
1、一方面，本公开提供了一种用于减少核酸文库中的脱氨基核苷酸碱基的方法，该方法包括：提供多个线性核酸文库分子，其中该多个线性核酸文库分子中的各个文库分子包含接合至具有针对表面捕获引物的结合序列的至少一个通用衔接子序列的目的序列以及一个具有针对测序引物的结合序列的通用衔接子序列，并且其中这些文库分子中的至少一个文库分子携带一个或多个脱氨基核苷酸碱基；使该多个核酸文库分子与移除脱氨基核苷酸碱基的试剂接触，由此产生至少一个携带脱碱基位点的文库分子；使该多个核酸文库分子成环以产生多个共价闭合环状文库分子；在适用于使各个共价闭合环状文库分子与表面捕获引物杂交的条件下，将该多个共价闭合环状文库分子分配到具有多个固定的表面捕获引物的支持物上；进行滚环扩增反应以产生多个固定至该支持物的核酸多联体模板分子；以及对该多个核酸多联体模板分子进行测序以确定该多联体模板分子的至少一部分的序列。
2、在一些实施例中，该方法进一步包括(g)使该多个共价闭合环状文库分子与移除脱氨基核苷酸碱基的试剂接触，由此产生至少一个携带脱碱基位点的环状文库分子。
3、在一些实施例中，步骤(b)的移除脱氨基核苷酸碱基的试剂包含dna糖基化酶(udg)以及(i)ap裂解酶、(ii)endo iv核酸内切酶、(iii)fpg糖基化酶/ap裂解酶、和/或(iv)endo viii糖基化酶/ap裂解酶、或它们的组合。
4、在一些实施例中，步骤(g)的移除脱氨基核苷酸碱基的试剂包含dna糖基化酶(udg)以及(i)ap裂解酶、(ii)endo iv核酸内切酶、(iii)fpg糖基化酶/ap裂解酶、和/或(iv)endo viii糖基化酶/ap裂解酶、或它们的组合。
5、在一些实施例中，该多个固定的表面捕获引物拴系至支持物上的聚合物涂层。
6、在一些实施例中，步骤(e)的滚环扩增反应包括链置换聚合酶和多个核苷酸，该多个核苷酸包括datp、dgtp、dctp、dttp和/或dutp。
7、在一些实施例中，该多个固定的表面捕获引物位于支持物上的预定位置处。
8、在一些实施例中，该多个固定的表面捕获引物位于支持物上的随机位置处。
9、在一些实施例中，支持物上的该多个固定的多联体模板分子彼此流体连通以允许试剂的溶液流动到支持物上。在一些实施例中，试剂的溶液包含酶、核苷酸和二价阳离子。
10、在一些实施例中，该多个固定的多联体模板分子基本上同时以大规模并行方式与试剂反应。
11、在一些实施例中，聚合物涂覆的支持物上的多个固定的多联体模板分子的密度为102-1012/mm2。
12、在一些实施例中，对多个固定的多联体进行测序包括：使该多个固定的多联体分子与(i)多个测序聚合酶和(ii)多个可溶性测序引物接触，其中该接触在适合形成多个复合聚合酶的条件下进行，每个复合聚合酶包含与核酸双链体结合的测序聚合酶，其中该核酸双链体包含与可溶性测序引物杂交的多联体分子；在适用于将至少一个核苷酸与复合测序聚合酶结合的条件下使多个复合测序聚合酶与多个核苷酸接触，其中该多个核苷酸包括至少一个用荧光团标记并且在糖3'位置处具有可移除链终止部分的核苷酸类似物；将至少一个核苷酸掺入到杂交的测序引物的3'端中，由此产生多个新生的延伸的测序引物；以及检测经掺入的核苷酸并识别经掺入的核苷酸的核碱基。
13、在一些实施例中，该多个核苷酸在3'糖基团处包含可移除链终止部分，其中该可移除链终止部分包含烷基基团、烯基基团、炔基基团、烯丙基基团、芳基基团、苄基基团、叠氮基团、叠氮基基团、o-叠氮基甲基基团、胺基团、酰胺基团、酮基基团、异氰酸酯基团、磷酸酯基团、硫代基团、二硫基团、碳酸酯基团、脲基团或甲硅烷基基团。
14、在一些实施例中，可移除链终止部分可用化学化合物裂解以在糖基团上产生可延伸的3'oh部分。
15、在一些实施例中，该多个核苷酸包括选自由以下项组成的组的一种类型的核苷酸：datp、dgtp、dctp、dttp和dutp。
16、在一些实施例中，该多个核苷酸包括选自由以下项组成的组的两种或更多种类型的核苷酸的任意组合的混合物：datp、dgtp、dctp、dttp和dutp。
17、在一些实施例中，对多个固定的多联体进行测序包括：使该多个固定的多联体分子与(i)多个测序聚合酶和(ii)多个可溶性测序引物接触，其中该接触在适合形成多个第一复合聚合酶的条件下进行，每个第一复合聚合酶包含与核酸双链体结合的测序聚合酶，其中该核酸双链体包含与可溶性测序引物杂交的多联体分子；在适用于将多价分子的互补核苷酸单元与该多个第一复合聚合酶中的至少两个第一复合聚合酶结合以形成多个多价-复合聚合酶的条件下，使多个复合测序聚合酶与多个可检测地标记的多价分子接触，由此形成多个多价-复合聚合酶，并且该条件抑制该互补核苷酸单元掺入到该多个多价-复合聚合酶的测序引物中，其中多个多价分子中的各个多价分子包含附接至多个核苷酸臂的核心，并且每个核苷酸臂附接至核苷酸单元；检测该多个多价-复合聚合酶；以及识别与该多个多价-复合聚合酶中的该多个第一复合聚合酶结合的互补核苷酸单元的核碱基，由此确定核酸模板的序列。
18、在一些实施例中，该方法进一步包括：解离多个多价-复合聚合酶，移除多个第一测序聚合酶及其结合的多价分子，并保留多个核酸双链体；使步骤(e)的多个保留的核酸双链体与多个第二测序聚合酶接触，其中该接触在适用于将多个第二测序聚合酶与多个保留的核酸双链体结合条件下进行，由此形成多个第二复合聚合酶，每个第二复合聚合酶包含与保留的核酸双链体结合的第二测序聚合酶；使多个第二复合聚合酶与多个核苷酸接触，该多个核苷酸包括至少一个用荧光团标记并且在糖3'位置处具有可移除链终止部分的核苷酸类似物，其中该接触在适用于将来自多个核苷酸的互补核苷酸与步骤(f)的第二复合聚合酶中的至少两个第二复合聚合酶结合的条件下进行，由此形成多个核苷酸-复合聚合酶，并且该条件适用于促进结合的互补核苷酸掺入到核苷酸-复合聚合酶的测序引物中。
19、在一些实施例中，该方法进一步包括检测掺入到核苷酸-复合聚合酶的测序引物中的互补核苷酸。
20、在一些实施例中，该方法进一步包括检测掺入到核苷酸-复合聚合酶的测序引物中的互补核苷酸；以及识别掺入到核苷酸-复合聚合酶的测序引物中的互补核苷酸的核碱基。
21、另一方面，本文提供了一种用于通过形成至少一个亲和力复合物来进行测序的方法，该方法包括：通过对包含至少一个脱碱基位点的闭合环状核酸分子进行滚环扩增来产生核酸多联体，其中通过使闭合环状核酸分子或对应的线性核酸分子与移除脱氨基核苷酸碱基的试剂接触来产生该脱碱基位点；将第一通用测序引物、第一测序聚合酶和第一可检测地标记的多价分子与多联体分子的第一部分结合，由此形成第一结合复合物，其中第一多价分子的第一核苷酸单元与第一测序聚合酶结合；将第二通用测序引物、第二测序聚合酶和第一可检测地标记的多价分子与同一多联体分子的第二部分结合，由此形成第二结合复合物，其中第一多价分子的第二核苷酸单元与第二测序聚合酶结合，其中包括同一多价分子的第一结合复合物和第二结合复合物形成亲和力复合物，其中第一可检测地标记的多价分子包含附接至多个核苷酸臂的核心，并且每个核苷酸臂附接至核苷酸单元，其中多联体分子包含目的序列(110)的两个或更多个串联重复序列以及结合第一通用测序引物和第二通用测序引物的通用引物结合位点，并且其中该接触在适合于抑制第一结合复合物和第二结合复合物中结合的第一核苷酸单元和第二核苷酸单元的聚合酶催化掺入的条件下进行；检测同一多联体分子上的第一结合复合物和第二结合复合物，以及识别第一结合复合物中的第一核苷酸单元，由此确定多联体模板分子的第一部分的序列，并识别第二结合复合物中的第二核苷酸单元，由此确定多联体模板分子的第二部分的序列。
22、在一些实施例中，附接至各个多价分子的核心的多个核苷酸臂具有相同类型的核苷酸单元，并且其中该核苷酸单元的类型选自由以下项组成的组：datp、dgtp、dctp、dttp和dutp。
23、在一些实施例中，该多个多价分子包括两种或更多种类型的多价分子的混合物，每种类型具有选自由以下项组成的组的核苷酸单元：datp、dgtp、dctp、dttp和dutp。
24、在一些实施例中，该多个核苷酸在3'糖基团处包含可移除链终止部分，其中该可移除链终止部分包含烷基基团、烯基基团、炔基基团、烯丙基基团、芳基基团、苄基基团、叠氮基团、叠氮基基团、o-叠氮基甲基基团、胺基团、酰胺基团、酮基基团、异氰酸酯基团、磷酸酯基团、硫代基团、二硫基团、碳酸酯基团、脲基团或甲硅烷基基团。
25、在一些实施例中，可移除链终止部分可用化学化合物裂解以在糖基团上产生可延伸的3'oh部分。
26、在一些实施例中，该多个核苷酸包括选自由以下项组成的组的一种类型的核苷酸：datp、dgtp、dctp、dttp和dutp。
27、在一些实施例中，该多个核苷酸包括选自由以下项组成的组的两种或更多种类型的核苷酸的任意组合的混合物：datp、dgtp、dctp、dttp和dutp。
28、在一些实施例中，支持物包括玻璃基底。
29、在一些实施例中，支持物包括塑料基底。
30、在一些实施例中，支持物用具有不大于45度的水接触角的至少一个亲水性聚合物涂层钝化。在一些实施例中，至少一个亲水性聚合物涂层包含选自由以下项组成的组的分子：聚乙二醇(peg)、聚(乙烯醇)(pva)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(pvp)、聚(丙烯酸)(paa)、聚丙烯酰胺、聚(n-异丙基丙烯酰胺)(pnipam)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(pma)、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)(phema)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(poegma)、聚谷氨酸(pga)、聚赖氨酸、聚葡萄糖苷、链霉亲和素和葡聚糖。
31、在一些实施例中，该方法进一步包括根据步骤(f)的测序确定碱基识别误差百分比。
32、在一些实施例中，该方法进一步包括根据碱基识别误差百分比确定测序数据的质量分数。在一些实施例中，质量分数是phred质量分数。