一种提高植物产量的多肽及其应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程领域，具体地，涉及一种用于改良植物性状的突变多肽，尤其涉及一种提高植物产量的多肽及其应用。

背景技术：

1、大豆是人类油脂和蛋白质的重要来源，是世界最重要的经济作物之一。提高大豆产量是大豆育种的重要目标，具有重要的经济价值。目前已有文献报道了多种途径提高大豆产量，例如，gmjag1基因单个氨基酸的突变可使大豆三粒荚和四粒荚的比例大幅度提高，使大豆的圆叶型变为尖叶型，最终大豆产量提升约9％，并通过定向选育gmjag1突变类型定向选育了多四粒荚的高产大豆品种。

2、pyl(pyrabactin resistance 1-like)蛋白是植物aba通路中的重要受体，本发明利用pyl的突变体，在大豆中过表达，能够大幅提高大豆产量，为大豆增产提供了更优的技术方案。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供了一种脱落酸受体蛋白(pyl)的突变多肽本发明的突变多肽可以提高大豆产量。

2、本发明一方面提供了一种脱落酸受体蛋白(pyl)的突变多肽，所述突变多肽与亲本pyl氨基酸序列相比，在对应于seq id no.1所示的氨基酸序列的第147位氨基酸位点处存在突变。

3、在一个实施方式中，所述的突变为氨基酸的插入、缺失或替换。

4、在一个实施方式中，所述第147位氨基酸突变为非e的氨基酸，例如，a，v，g，q，f，w，y，d，n，r，k，m，s，t，c，p，h，l，i；优选，l。

5、另一方面，本发明提供了一种突变型的pyl多肽，所述突变型的pyl多肽选自以下i-iii任意一组：

6、i、由seq id no.1所示氨基酸序列在包含以下氨基酸位点处产生突变得到的突变型的pyl多肽：第147位氨基酸；

7、ii、与i所述的突变型的pyl多肽相比，具有i中所述的突变位点；并且，与i所述的突变型pyl多肽相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同一性的突变型的pyl多肽；

8、iii、与i所述的突变型的pyl多肽相比，具有i中所述的突变位点；并且，与i所述的突变型pyl多肽相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；所述一个或多个氨基酸包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加。

9、在一个实施方式中，所述突变多肽的亲本氨基酸序列如seq id no.1所示。

10、在一个实施方式中，所述亲本pyl为pyl2。

11、在一个实施方式中，所述亲本pyl多肽来源于单子叶植物或双子叶植物。

12、在一个实施方式中，所述亲本pyl多肽来源于选自下组的一种或多种植物：禾本科、豆科、黎科、十字花科植物。

13、在一个实施方式中，所述亲本pyl多肽来源于选自下组的一种或多种植物：拟南芥、水稻、烟草、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、草莓。

14、在一个实施方式中，所述亲本pyl多肽来源于拟南芥，其氨基酸序列如seq idno.1所示。

15、在一个实施方式中，所述亲本pyl多肽的氨基酸序列与seq id no.1所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。

16、在一个实施方式中，所述突变多肽为seq id no.1所示的多肽经突变形成的。

17、在一个实施方式中，所述的突变多肽除所述上述突变外，其余的氨基酸序列与seqid no.1所示的序列相同或基本相同。

18、在另一优选例中，所述的基本相同是至多有50个(较佳地为1-20个，更佳地为1-10个、更佳地1-5个)氨基酸不相同，其中，所述的不相同包括氨基酸的取代、缺失或添加。

19、本领域技术人员清楚，可以改变蛋白质的结构而不对其活性和功能性产生不利影响，例如可以在蛋白质氨基酸序列中引入一个或多个保守性氨基酸取代，而不会对蛋白质分子的活性和/或三维结构产生不利影响。本领域技术人员清楚保守性氨基酸取代的实例以及实施方式。具体的说，可以用与待取代位点属于相同组的另一氨基酸残基取代该氨基酸残基，即用非极性氨基酸残基取代另一非极性氨基酸残基，用极性不带电荷的氨基酸残基取代另一极性不带电荷的氨基酸残基，用碱性氨基酸残基取代另一碱性氨基酸残基，和用酸性氨基酸残基取代另一酸性氨基酸残基。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。只要取代不导致蛋白质生物活性的失活，则一种氨基酸被属于同组的其他氨基酸替换的保守取代落在本发明的范围内。因此，本发明的蛋白可以在氨基酸序列中包含一个或多个保守性取代,这些保守性取代最好根据表1进行替换而产生。另外，本发明也涵盖还包含一个或多个其他非保守取代的蛋白，只要该非保守取代不显著影响本发明的蛋白质的所需功能和生物活性即可。保守氨基酸置换可以在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行。“非必需”氨基酸残基是可以发生改变(缺失、取代或置换)而不改变生物活性的氨基酸残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性所需的。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的置换。氨基酸置换可以在pyl的非保守区域中进行。一般而言，此类置换不对保守的氨基酸残基，或者不对位于保守基序内的氨基酸残基进行，其中此类残基是蛋白质活性所需的。然而，本领域技术人员应当理解，功能变体可以具有较少的在保守区域中的保守或非保守改变。

20、本领域熟知，可以从蛋白质的n和/或c末端改变(置换、删除、截短或插入)一或多个氨基酸残基而仍保留其功能活性。因此，从hppd蛋白的n和/或c末端改变了一或多个氨基酸残基、同时保留了其所需功能活性的蛋白，也在本发明的范围内。这些改变可以包括通过现代分子方法例如pcr而引入的改变，所述方法包括借助于在pcr扩增中使用的寡核苷酸之中包含氨基酸编码序列而改变或延长蛋白质编码序列的pcr扩增。

21、应认识到，蛋白质可以以各种方式进行改变，包括氨基酸置换、删除、截短和插入，用于此类操作的方法是本领域通常已知的。例如，可以通过对dna的突变来制备acc蛋白的氨基酸序列变体。还可以通过其他诱变形式和/或通过定向进化来完成，例如，使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，结合相关的筛选方法，来进行单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。

22、本领域技术人员能够理解，本发明pyl蛋白中的这些微小氨基酸变化可以出现(例如天然存在的突变)或者产生(例如使用r-dna技术)而不损失蛋白质功能或活性。如果这些突变出现在蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则多肽的性质可改变，但多肽可保持其活性。如果存在的突变不接近催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则可预期较小影响。

23、本领域技术人员可以根据本领域已知的方法，例如定位诱变或蛋白进化或生物信息系的分析，来鉴定pyl蛋白的必需氨基酸。蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域也能够通过结构的物理分析而确定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，结合推定的关键位点氨基酸的突变来确定。

24、表1

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26、

27、术语“axxb”表示第xx位的氨基酸a变为氨基酸b，如无特别说明，均是从n端起第xx位的氨基酸a变为氨基酸b。例如，e147l表示第147位的e突变为l。

28、本发明所述蛋白质内的特定氨基酸位置(编号)是利用标准序列比对工具通过将目标蛋白质的氨基酸序列与seq id no.1进行比对而确定的，譬如用smith-waterman运算法则或用clustalw2运算法则比对两个序列，其中当比对得分最高时认为所述序列是对准的。比对得分可依照wilbur,w.j.and lipman,d.j.(1983)rapid similarity searchesofnucleic acid and protein data banks.proc.natl.acad.sci.usa,80:726-730中所述的方法进行计算。在clustalw2(1.82)运算法则中优选使用默认参数：蛋白质缺口开放罚分＝10.0；蛋白质缺口延伸罚分＝0.2；蛋白质矩阵＝gonnet；蛋白质/dna端隙＝-1；蛋白质/dnagapdist＝4。优选采用alignx程序(vectornti组中的一部分)，以适于多重比对的默认参数(缺口开放罚分:10；缺口延伸罚分0.05)通过将蛋白质的氨基酸序列与seq id no.1进行比来确定本发明所述蛋白质内特定氨基酸的位置。

29、另一方面，本发明提供了一种融合蛋白，包含所述的突变多肽或其他生物活性片段。

30、进一步的，所述融合蛋白还包括与所述的突变多肽融合的蛋白，例如，标签肽、质体引导肽或调控元件。其中，标签肽如，组氨酸标签6xhis；质体引导肽，例如引导到叶绿体内的肽；调控元件，例如启动子序列、终止子序列、前导序列、多聚腺苷酸化序列、标记基因等。

31、另一方面，本发明提供了一种多核苷酸，编码所述突变多肽或其活性片段的多核苷酸，或者编码所述融合蛋白。

32、在一个实施方式中，所述的多核苷酸选自下组：基因组序列、cdna序列、rna序列、或其组合。

33、在一个实施方式中，所述的多核苷酸优选是单链的或双链的。

34、在一个实施方式中，所述的多核苷酸在所述突变多肽的orf的侧翼还额外含有选自下组的辅助元件：信号肽、分泌肽、标签序列(如6his)、核定位信号或其组合。

35、在一个实施方式中，该多核苷酸还包含与所述突变多肽的orf序列操作性连接的启动子。

36、在一个实施方式中，所述的启动子选自下组：组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子、或者强启动子。

37、在一个实施方式中，所述启动子为aa6启动子或rd29a启动子。

38、另一方面，本发明提供了一种核酸构建体，所述核酸构建体含有所述多核苷酸以及与之可操作连接的表达调控元件。

39、在一个实施方式中，所述的调控元件选自下组中的一种或多种：增强子、转座子、启动子、终止子、前导序列、多腺苷酸序列、标记基因。

40、另一方面，本发明还提供了一种载体，所述载体包含有编码本发明的突变型pyl多肽或者融合蛋白的核酸序列，优选的，所述载体还包括与上述核酸序列可操作连接的表达调控元件。

41、在一个实施方式中，所述的载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体或整合载体。

42、在一个实施方式中，所述载体为植物表达载体。

43、在一个实施方式中，所述的载体为可转染或转化植物细胞的表达载体。

44、在一个实施方式中，所述的载体为农杆菌ti载体。

45、在一个实施方式中，载体可以是对宿主细胞内源性的pyl基因进行基因编辑的载体。

46、在一个实施方式中，所述表达载体中还至少含有一个复制起点，以实现自我复制。

47、在一个实施方式中，所述载体可以是当引入宿主细胞时被整合入基因组中并与其所整合入的染色体一起复制的载体。

48、在一个实施方式中，所述的构建物整合到所述载体的t-dna区。

49、在一个实施方式中，所述载体是环状的或线状的。

50、本文所用术语“载体”是指设计用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。“表达载体”是指具有外源细胞中掺入和表达异源dna片段的能力的载体。许多原核和真核表达载体可商购获得。选择合适的表达载体是本领域技术人员所熟知的。

51、载体可以是质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的。

52、优选地，本发明中的载体是质粒。

53、另一方面，本发明还提供一种工程化的宿主细胞，所述宿主细胞包含上述核酸构建物，或上述载体。

54、在一个实施方式中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

55、在一个实施方式中，所述原核细胞来源于大肠杆菌、酵母或农杆菌。

56、在一个实施方式中，所述的细胞为植物细胞。

57、在一个实施方式中，所述的植物选自下组：单子叶植物、双子叶植物、裸子植物或其组合。

58、在一个实施方式中，所述的植物包括：拟南芥、小麦、大麦、燕麦、玉米、水稻、高粱、粟、大豆、花生、烟草、番茄、拟南芥、马铃薯、白菜、油菜、生菜、黄瓜、茼蒿、空心菜等、或其组合。

59、在一个实施方式中，所述宿主细胞是用选自下组的方法将上述核酸构建物导入细胞的：农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法、电击法、超声波法和聚乙二醇(peg)介导法。

60、另一方面，本发明提供了上述突变多肽、或上述融合蛋白，或上述多核苷酸，或上述核酸构建体，或上述宿主细胞在制备转基因植物中的应用。

61、另一方面，本发明提供了上述突变多肽、或上述融合蛋白，或上述多核苷酸，或上述核酸构建体，或上述宿主细胞在制备试剂或试剂盒中的应用，所述试剂或试剂盒用于制备转基因植物。

62、另一方面，本发明提供了一种制备性状改良的植物的方法，所述方法包括在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物中表达所述突变多肽的步骤。进一步的，所述方法还包括从所述性状改良的植物收获植物种子的步骤。

63、优选的，所述表达为过表达。

64、在一个实施方式中，所述方法包括使用组成型启动子或诱导性启动子对所述突变多肽进行过表达的操作。

65、在一个实施方式中，所述方法包括以下步骤：

66、将所述的突变多肽、或所述的融合蛋白，或所述的多核苷酸，或所述的核酸构建体，或所述的宿主细胞导入到所述植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物中。

67、在一个实施方式中，所述导入为通过农杆菌导入。

68、在一个实施方式中，所述导入为通过基因枪导入。

69、另一方面，本发明还提供了一种性状改良的植物，所述性状改良的植物为上述方法制备得到的性状改良的植物。

70、在一个实施方式中，所述性状改良为提高植物产量，优选地为，提高植物种子产量。

71、本发明中，提高植物种子产量，是指上述经性状改良的植物与受体对照植物相比，植物种子的产量提高至少5％、至少10％、至少15％、至少20、至少25％、至少28％或至少30％。

72、在一个实施方式中，所述植物包括任何可进行转化技术的高等植物类型，包括单子叶植物、双子叶植物和裸子植物。

73、在一个实施方式中，所述的植物选自下组：禾本科植物、豆科植物、十字花科植物、茄科、伞形科、或其组合。

74、在一个实施方式中，所述的植物包括：拟南芥、小麦、大麦、燕麦、玉米、水稻、高粱、粟、大豆、花生、烟草、番茄、拟南芥、马铃薯、白菜、油菜、菠菜、生菜、黄瓜、茼蒿、空心菜、芹菜、油麦菜、或其组合，优选地为，大豆。

75、另一方面，本发明提供了上述突变多肽、或上述融合蛋白，或上述多核苷酸，或上述核酸构建体，或上述宿主细胞在制备性状改良的植物中的应用。

76、另一方面，本发明提供了上述突变多肽、或上述融合蛋白，或上述多核苷酸，或上述核酸构建体，或上述宿主细胞在制备用于对植物进行性状改良的试剂或试剂盒的应用。

77、在一个实施方式中，所述性状改良为提高植物产量，优选地为，提高植物种子的产量。

78、另一方面，本发明提供了一种制备转基因植物的方法，所述转基因植物利用上述方法制备得到的植物与其他植物杂交得到的植物。

79、本发明中，所述的植物包括：拟南芥、小麦、大麦、燕麦、玉米、水稻、高粱、粟、大豆、花生、烟草、番茄、拟南芥、马铃薯、白菜、油菜、菠菜、生菜、黄瓜、茼蒿、空心菜、芹菜、油麦菜、或其组合，优选地为，大豆。

80、本发明提供可一种突变多肽，在植物中表达该突变多肽，能够对植物进行性状改良，提高植物的产量，尤其是大豆产量，具有重要经济意义和广泛的应用前景。

81、下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

82、本技术涉及的序列信息如下：

83、