一种验证mRNA剪接突变和无义介导的mRNA降解的质粒及其应用的制作方法

本发明涉及生物，更具体的说是涉及一种验证mrna剪接突变和无义介导的mrna降解的质粒及其应用。

背景技术：

1、目前罕见病的诊断由于剪接突变和无义终止突变发生的病例越来越多的被检出，现有手段通常是采用以下两种方法验证剪接突变造成的mrna异常问题：(1)抽取患者外周血进行rt-pcr测序验证，此方法比较简单，但是也存在一些问题，一是基因的表达丰度问题，有些基因在血细胞低表达或者不表达导致无法成功进行实验；二是取样问题，有些病例无法后续拿到患者外周血导致的不能进行实验；三是细胞内存在rna检测机制，有些变异剪接产物会被nmd降解掉导致实验结果不全面。(2)传统minigene技术，传统minigene技术是通过质粒构建插入一段携带dna突变的基因区域导入细胞进行rt-pcr测序验证，此方法进一步克服了患者血细胞存在的一些弊端。但是这两种方法都不能进一步有效验证后续mrna降解及蛋白翻译的功能学验证。

2、综上，如何提供一种可以有效验证mrna剪接和蛋白翻译形成的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种验证mrna剪接突变和无义介导的mrna降解的质粒及其应用。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种验证mrna剪接突变和无义介导的mrna降解的质粒，所述质粒包括如下以特定顺序连接的元件：

4、hpgkpromoter，其核苷酸序列如seq id no:1所示；

5、egfp-a，其核苷酸序列如seq id no:2所示；

6、β-globin intron，其核苷酸序列如seq id no:3所示；

7、egfp-b，其核苷酸序列如seq id no:4所示；

8、linker，其核苷酸序列如seq id no:5所示；

9、mcs，其核苷酸序列如seq id no:6所示；

10、bgh poly(a)signal，其核苷酸序列如seq id no:7所示；

11、剩余元件，其核苷酸序列如seq id no:8所示；

12、所述剩余原件位于bghpoly(a)signal下游，与hpgkpromoter序列成环；

13、所述剩余元件包括如下以特定顺序连接的元件：f1 ori、lac operator、lacpromoter、cap binding site、ori、ampr、ampr promoter。

14、所取得的有益效果：该质粒可以验证基因剪接突变导致的mrna剪接之外，还可以进一步验证蛋白形成翻译以及表达相对水平，无义介导的mrna降解这一系列下游功能学问题。

15、进一步的，其核苷酸序列如seq id no:9所示。

16、gacggatcgggagatctggggttggggttgcgccttttccaaggcagccctgggtttgcgcagggacgcggctgctctgggcgtggttccgggaaacgcagcggcgccgaccctgggtctcgcacattcttcacgtccgttcgcagcgtcacccggatcttcgccgctacccttgtgggccccccggcgacgcttcctgctccgcccctaagtcgggaaggttccttgcggttcgcggcgtgccggacgtgacaaacggaagccgcacgtctcactagtaccctcgcagacggacagcgccagggagcaatggcagcgcgccgaccgcgatgggctgtggccaatagcggctgctcagcagggcgcgccgagagcagcggccgggaaggggcggtgcgggaggcggggtgtggggcggtagtgtgggccctgttcctgcccgcgcggtgttccgcattctgcaagcctccggagcgcacgtcggcagtcggctccctcgttgaccgaatcaccgacctctctccccagctctggctaactagagaacccactgcttactggctgctagcgccaccatggtcagcaagggcgaggagctgttcaccggcgtggtgcccatcctggtggagctggacggcgacgtgaacggccacaagttcagcgtgagcggcgagggcgagggcgacgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctggtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagagcgccatgcccgagggctacgtgcaggagcgcaccatcttcttcaaagacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctgggccacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtgtacatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctggccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacgtgagtttggggacccttgattgttctttctttttcgctattgtaaaattcatgttatatggagggggcaaagttttcagggtgttgtttagaatgggaagatgtcccttgtatcaccatggaccctcatgataattttgtttctttcactttctactctgttgacaaccattgtctcctcttattttcttttcattttctgtaactttttcgttaaactttagcttgcatttgtaacgaatttttaaattcacttttgtttatttgtcagattgtaagtactttctctaatcacttttttttcaaggcaatcagggtatattatattgtacttcagcacagttttagagaacaattgttataattaaatgataaggtagaatatttctgcatataaattctggctggcgtggaaatattcttattggtagaaacaactacatcctggtcatcatcctgcctttctctttatggttacaatgatatacactgtttgagatgaggataaaatactctgagtccaaaccgggcccctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctgagcacccagagcgccctgagcaaggaccccaacgagaagcgcgaccacatggtgctgctggagttcgtgaccgccgccggcatcaccctgggcatggacgagctgtacaagggtggcggaagcggaggtggatccactagtccagtgtggtggaattctgcagatatccagcacagtggcggccgctcgagtctagagggcccgtttaaataagctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtgtcatgtctgtataccgtcgacctctagctagagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtc，seq id no:9。

17、进一步的，制备方法如下：

18、将核苷酸序列如seq id no:10所示的片段和核苷酸序列如seq id no:11所示的片段进行基因重组、转化。

19、进一步的，核苷酸序列如seq id no:10所示的片段的制备方法如下：

20、以质粒pmini-copgfp为模板进行扩增，所用引物如下：

21、psplicer-pro-zt-f：tcatgtctgtataccgtcgacctcta，seq id no:12；

22、psplicer-pro-zt-r：agccagtaagcagtgggttctctag，seq id no:13。

23、上述的质粒在验证mrna剪接突变和无义介导的mrna降解中的应用。

24、进一步的，所述质粒可以用于验证anos1基因的突变位点nm_000216:c.1129_1130at>tg、mef2c基因的突变位点nm_002397:c.258g>a。

25、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：本发明提供了一种可以有效验证mrna剪接和蛋白翻译形成的实验方法，以及一种无义介导的mrna降解的方法学工具，为基因剪接突变导致的罕见病的诊断、功能学研究、药物开发提供了一种新的方法。本发明方法只需要将2组质粒导入细胞，通过rt-pcr(rna剪接验证)、rt-qpcr(mrna定量)、western blot(蛋白定量)3种常规实验方法即可验证出基因剪接突变导致的mrna剪接，蛋白形成翻译以及表达相对水平，无义介导的mrna降解这一系列下游功能学问题，有效填补了目前此领域的空白。