分泌弓形虫单克隆抗体和杂交瘤细胞株以及应用的制作方法

本发明属于弓形虫抗体检测，具体涉及分泌弓形虫单克隆抗体和杂交瘤细胞株以及应用。

背景技术：

1、弓形虫病是由弓形虫引起的一种世界性分布的人兽共患原虫病，在脊椎动物中广泛传播，几乎可以感染所有温血动物。弓形虫生长周期需要两个宿主：中间宿主和终末宿主。中间宿主广泛，多种冷血、温血动物都会被感染，终末宿主则是猫科动物。弓形虫病是一种机会性致病原虫病，多为隐性感染，无明显临床症状，很少发现健康宿主出现严重病症，而对胎儿和免疫缺陷患者的感染则尤其严重。弓形虫(toxoplasma gondii)是专性细胞内寄生原虫,可感染大部分哺乳动物(包括人类)。作为一种机会性致病原虫,弓形虫入侵宿主后,若宿主免疫功能正常,快速分裂增殖的速殖子可转化为缓殖子,形成包囊,在宿主细胞内存活数年,不表现明显症状。但若宿主免疫功能受损或低下,缓殖子可转换为速殖子,引发多种症状并可导致宿主死亡。

2、乳胶凝集试验(lat)作为国际上公认的弓形虫检测“金标准”，具有准确率高、特异性好等优点，但该方法敏感度较低，为此，急切需要建立快速、灵敏的弓形虫的检测方法。中国专利cn104965086a公开了一种犬弓形虫抗体间接elisa检测试剂盒。该方案通过基因克隆技术和原核表达，获取弓形虫重组蛋白rop5，试剂盒中使用弓形虫rop5重组蛋白包被固相载体，建立间接elisa检测方法。该方法适用于犬弓形虫病的流行病学调查、犬弓形虫感染的检测和临床诊断。但是，该技术方案并未制备针对抗原蛋白的单克隆抗体，而单克隆抗体的制备是建立优良elisa检测方法的基础，缺少适当的单克隆抗体会导致建立的检测体系的准确度和灵敏度不理想。如何能够获得用于弓形虫感染检测的单克隆抗体，以及建立高准确度和灵敏度的检测体系，是现有技术中亟待解决的问题。

技术实现思路

1、本发明意在提供一种用于弓形虫抗体检测的阻断elisa试剂盒，以解决现有技术中的弓形虫感染检测缺少适当的单克隆抗体和相应的检测体系的技术问题。

2、为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种用于弓形虫抗体检测的阻断elisa试剂盒，包括7h11单克隆抗体、抗弓形虫多克隆抗体、弓形虫全虫蛋白包被的固相载体、酶标二抗、显色液和终止液；7h11单克隆抗体由保藏号为cgmcc no.45755的杂交瘤细胞株所分泌。

4、本方案还提供了一种抗srs2抗原的单克隆抗体，其特征在于，其由保藏号为cgmccno.45755的杂交瘤细胞株所分泌。

5、本方案还提供了一种杂交瘤细胞株，其保藏号为cgmcc no.45755；其用于分泌抗srs2抗原的抗体。

6、本方案还提供了一种抗srs2抗原的单克隆抗体在制备检测弓形虫感染的试剂盒中的应用，所述试剂盒为用于检测弓形虫抗体的阻断elisa试剂盒。

7、本技术方案的原理以及优点在于：

8、本技术方案筛选获得了一种针对srs2抗原的单克隆抗体，可利用上述单克隆抗体对样本中的弓形虫抗体进行检测，进而判断样本是否受到弓形虫的感染。免疫原是单克隆抗体制备的关键，在本技术方案中，以弓形虫全虫蛋白为免疫原，包括了所有虫体所表达的蛋白，且其蛋白构象天然，再经过两轮筛选出特异性针对srs2抗原的单克隆抗体。

9、弓形虫多种表面抗原均属于srs(sag1-related sequences)蛋白超家族，srs蛋白一般在特定的发育阶段表达,速殖子期和缓殖子期抗原有一定差异性。现有技术中，对弓形虫棒状体蛋白、弓形虫微线体蛋白等的研究比较多，但是针对上述弓形虫棒状体蛋白、弓形虫微线体蛋白抗原制备的单克隆抗体，尚未用于阻断elisa试剂盒的构建。本技术方案首次筛选获得了针对srs2抗原的单克隆抗体，并在后续的阻断elisa检测中取得了理想的检测效果。

10、发明人研究发现，序列为seq id no.1弓形虫表面抗原1相关序列2型蛋白(tgsrs2、srs2)在弓形虫速殖子和缓殖子各阶段皆大量表达，是检测弓形虫病的新抗原。现有技术中，在制备用于检测弓形虫的抗体的尝试中，尚未使用到srs2抗原，大多是使用弓形虫虫体全蛋白作为抗原、或者弓形虫微线体蛋白3(mic3)、或者金属蛋白酶(ftsh1)等进行免疫以及制备相应的单克隆抗体。本技术方案是首次尝试针对srs2作为抗原进行单克隆抗体的制备，srs2蛋白的免疫源性如何，由其免疫产生的单克隆抗体作用效果如何，现有技术中尚未见报道，为发明人首次尝试。制备获得的抗srs2单克隆抗体以srs2蛋白为靶点，可以实现基于srs2蛋白的弓形虫检测，增加了新的有效检测弓形虫的途径。

11、实际上，高效的抗srs2蛋白的抗体以及其杂交瘤细胞的制备的意义，不仅仅局限在弓形虫检测上。在细胞生物学、分子生物学领域，单克隆抗体是一种有力的研究工具。例如，蛋白质印记、免疫荧光等研究方法都需要特定的单克隆抗体来结合目的蛋白。针对弓形虫srs2蛋白在弓形虫发育过程中的作用以及对弓形虫致病性的影响，还需要本领域技术人员进一步的研究和探索。而高效的抗srs2蛋白的抗体的制备成功，为srs2蛋白的基础研究创造了条件，抗srs2蛋白的单克隆抗体可以制备成为与srs2蛋白特异性结合的一抗，在应用在蛋白质印记和免疫荧光等基础研究中。本领域普通技术人员知晓蛋白质印记、免疫荧光等研究方法中的一抗通常都是特异性结合目标蛋白(抗原)的单克隆抗体，因此，抗srs2蛋白的抗体可以毫无疑义地应用于srs2蛋白的蛋白质印记、免疫荧光等检测中。因此，抗srs2蛋白的抗体以及分泌该抗体的杂交瘤细胞可以进一步应用于srs2蛋白的定量或者定性检测中，例如，作为蛋白质印记检测或者免疫荧光检测的一抗。

12、进一步，弓形虫全虫蛋白包被的固相载体由如下方法制备：使弓形虫全虫蛋白溶液与固相载体接触并孵育，再经过洗涤、封闭、洗涤后，获得弓形虫全虫蛋白包被的固相载体。

13、进一步，弓形虫全虫蛋白由如下方法获取：将弓形虫虫体重悬于pbs中，在冰水浴中超声破碎虫体，然后离心收集上清液，获得弓形虫全虫蛋白。

14、进一步，所述抗弓形虫多克隆抗体由如下方法制备：使用弓形虫全虫蛋白免疫兔四次，每次0.2mg/只，收集血清，获得抗弓形虫多克隆抗体。

15、进一步，弓形虫多克隆抗体的工作稀释度为1:20，作用时间为1h；7h11单克隆抗体的工作浓度为0.0625μg/ml。

16、进一步，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg，其反应时间为1h，稀释度为1:10000；所述显色液为双组分tmb显色液；所述终止液为硫酸溶液。

17、进一步，一种抗srs2抗原的单克隆抗体，其由如下方法制备：

18、s1抗原蛋白的获取：对序列如seq id no.1所示的基因进行密码子优化，然后整合到表达载体上，获得重组质粒；将重组质粒转入宿主菌，诱导宿主菌表达抗原蛋白；再经菌体破碎、离心取上清以及纯化获得rsrs2蛋白；

19、s2制备弓形虫全虫蛋白：通过超声提取的方法从弓形虫虫体中提取获得弓形虫全虫蛋白；

20、s3杂交瘤细胞株获取：使用弓形虫全虫蛋白免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞；将骨髓瘤细胞和小鼠脾脏细胞融合，获得融合细胞；依次使用弓形虫全虫蛋白和rsrs2蛋白对融合细胞进行筛选，获得表达单克隆抗体的杂交瘤细胞；

21、s4单克隆抗体的纯化：使用杂交瘤细胞对小鼠进行腹腔注射诱导产生腹水；收集腹水并通过亲和柱纯化，获得单克隆抗体。

22、综上所述，本技术方案的有益效果在于：

23、(1)首次获得分泌中和弓形虫单克隆抗体杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株能够稳定、高效的分泌中和活性的单克隆抗体，并能实现大规模批量生产。

24、(2)首次利用具有中和弓形虫单克隆抗体建立了一种弓形虫抗体的阻断elisa检测方法。

25、(3)样品处理操作简便，阻断elisa检测方法成本低廉、反应快速、特异性强、敏感性高，从而不仅能够为弓形虫病的诊断提供参考，也为弓形虫抗体阴性动物的筛选的研究提供了条件。