一种提高线粒体全长扩增检测准确性的方法与流程

本发明涉及生物，特别涉及一种提高线粒体全长扩增检测准确性的方法。

背景技术：

1、线粒体是细胞内重要的细胞器，其主要功能是为细胞的各种生命活动提供能量。除了为细胞提供能量外，线粒体还参与细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并具有调节细胞生长和细胞周期的能力。线粒体有自己特有的基因组，其遗传方式与核基因不同，主要靠细胞质遗传，母系遗传为主。线粒体的基因组为双链环状结构，其大小为16.6kb，包含37个基因，分别编码2种rrna，22种trna和13种多肽。这些基因如果发生突变，往往会导致线粒体功能发生异常，造成人体患相关疾病，如：慢性进行性眼外肌瘫痪(cpeo)、keams-sayre综合征(kss)、肌阵挛性癫痫伴肌肉破碎红纤维(merrf)综合征等。进行线粒体基因组检测，能够有效的发现线粒体上发生的突变，为线粒体疾病研究和诊断提供有效的参考依据。

2、由于线粒体长度达到16k，一代测序进行线粒体的检测工作量较大，而且一代测序进行检测无法判断线粒体上的cnv情况。三代长扩增子测序可以直接对线粒体上的所有变异检测，但是目前三代测序市场覆盖度还较小。因此，目前市面上检测线粒体上的变异，主要通过二代测序进行。二代测序根据建库的方式不同又可以分为长片段扩增子打断建库和液相基因panel杂交捕获的方式。两种方式各有优点，比如长片段扩增的方式较为简单便宜。但是相对昂贵和复杂的杂交捕获的方式又能检测其他染色体的变异。显然如果单纯用于检测线粒体疾病，线粒体全长扩增后构建二代文库的方式更为主流。但是该种方法在实践的过程中发现，全长扩增的引物区域附近的变异往往会出现检测错误的现象。这可能是线粒体基因组为环状结构，引物在退火后延伸的时候容易发生错误，尤其是引物区附近。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种提高线粒体全长扩增检测准确性的方法，创造了一种提高线粒体全长基因检测准确性的方法，该方法显著提高检测准确性，可以有效的避免误诊和漏检。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了线粒体全长测序的方法，包括如下步骤：

4、步骤(1)：用全长扩增引物扩增待测线粒体核酸，获得全长扩增产物，构建扩增产物文库，获得扩增产物文库；

5、步骤(2)：用嵌合体引物扩增待测线粒体核酸，获得扩增子，构建扩增子文库，获得扩增子文库，所述嵌合体引物的扩增区域包含所述全长扩增引物的上游引物和/或下游引物的结合区域；

6、步骤(3)：混合所述扩增产物文库和所述扩增子文库，获得混合文库，对所述混合文库进行测序，获得线粒体全长序列。

7、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法中，在获得扩增子后、构建扩增子文库前，还包括对扩增子进行二轮扩增的步骤；

8、所述二轮扩增的引物与所述嵌合体引物不相同。

9、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法的所述全长扩增引物的上游引物具有：

10、(1)、如seq id no:1所示的核苷酸序列；或

11、(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或

12、(3)、与如(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；

13、所述全长扩增引物的下游引物具有：

14、(4)、如seq id no:2所示的核苷酸序列；或

15、(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(4)的相同或相似；或

16、(6)、与如(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；

17、所述多个为2个至5个。

18、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法的所述嵌合体引物包括引物组1和/或引物组2；

19、所述引物组1包括引物1和引物2；

20、所述引物组2包括引物3和引物4；

21、所述引物1、引物2、引物3和引物4具有接头；

22、所述引物1具有：

23、(7)、如seq id no:5所示的核苷酸序列；或

24、(8)、如(7)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(7)的相同或相似；或

25、(9)、与如(7)或(8)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；

26、所述引物2具有：

27、(10)、如seq id no:6所示的核苷酸序列；或

28、(11)、如(10)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(10)的相同或相似；或

29、(12)、与如(10)或(11)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；

30、所述引物3具有：

31、(13)、如seq id no:7所示的核苷酸序列；或

32、(14)、如(13)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(13)的相同或相似；或

33、(15)、与如(13)或(14)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；

34、所述引物4具有：

35、(16)、如seq id no:8所示的核苷酸序列；或

36、(17)、如(16)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(16)的相同或相似；或

37、(18)、与如(16)或(17)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；

38、所述多个为2个至5个。

39、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法的所述接头包括接头1或接头2；

40、所述接头1具有：

41、(19)、如seq id no:3所示的核苷酸序列；或

42、(20)、如(19)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(19)的相同或相似；或

43、(21)、与如(19)或(20)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；

44、所述接头2具有：

45、(22)、如seq id no:4所示的核苷酸序列；或

46、(23)、如(22)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(22)的相同或相似；或

47、(24)、与如(22)或(23)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；

48、所述多个为2个至5个。

49、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法的所述二轮扩增的引物包括引物5和引物6；

50、所述引物5具有：

51、(25)、如seq id no:9所示的核苷酸序列；或

52、(26)、如(25)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(25)的相同或相似；或

53、(27)、与如(25)或(26)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；

54、所述引物6具有：

55、(28)、如seq id no:10所示的核苷酸序列；或

56、(29)、如(28)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(28)的相同或相似；或

57、(30)、与如(28)或(29)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；

58、所述多个为2个至5个。

59、本发明还提供了引物组合，包括上述方法中的所述引物1、上述方法中的所述引物2、上述方法中的所述引物3和上述方法中的所述引物4。

60、在本发明的一些具体实施方案中，上述引物组合的所述引物1具有上述接头；所述引物2具有上述接头；所述引物3具有上述接头；所述引物4具有上述接头；所述接头包括上述接头1或上述接头2。

61、在本发明的一些具体实施方案中，上述引物组合还包括上述方法中的所述引物5和上述方法中的所述引物6。

62、在本发明的一些具体实施方案中，上述引物组合还包括上述方法中的所述全长扩增引物的上游引物和上述方法中的所述全长扩增引物的下游引物。

63、本发明的方法有如下效果：

64、实验结果表明，新增两个扩增子，测序结果完全正确，检测结果与其他检测方式完全一致，准确性为100％。

65、由实验结果可得出：由于16k扩增子较长，需要用更长的退火和延伸时间来完成一次扩增，因此这个过程相对来说更容易出现扩增错误，由于引物分子量较大，加上线粒体是环状结构，引物区域发生空间错配的概率就更大，尤其是pcr初期发生的错误，更加容易信号放大，最终导致错误信号的发生。而增加两个扩增子覆盖引物附近的区域，能有效纠正该区域出现的错误，因为扩增子本身片段较小，对于pcr来说小扩增子发生的错误的概率更低，因此能提高整个方法的准确性。