一种乙酰胆碱酯酶复合水凝胶光子晶体传感器和方法

本发明涉及作为环境污染物的有机磷农药检测，特别是一种乙酰胆碱酯酶复合水凝胶光子晶体传感器和方法。

背景技术：

1、作为农业生产中最常用的农药之一，有机磷农药，如敌百虫、乐果、马拉硫磷及其代谢产物在水、谷物和土壤中被广泛检测到，成为了一种广泛的环境污染物。这些有机磷农药可与生物体中的乙酰胆碱酯酶（ache）不可逆地结合，导致人类出现许多严重的健康问题，例如中枢神经系统毒性，癌症和基因突变。虽然现有的许多常规分析方法，如光谱技术、电化学技术、比色技术等，已经能实现对有机磷农药的精确定量，然而，在实际应用中，必须考虑这些实验设备的昂贵成本和测定方案的复杂性，难以在社会生产与生活中普及与推广。因此， 开发出一种成本低廉、制备和操作简单的传感器用于有机磷农药的检测在公共安全和环境保护领域均具有重要的意义。

2、光子晶体是由两种或两种以上具有不同折光系数的介质材料在亚微米尺度上按照一定的周期顺序排列而成的有序光学结构。光子晶体周期排列尺度与可见光波长处于同一个量级，当光波作用于光子晶体的周期性结构时通过布拉格衍射能够在一定频率范围内产生“光子带隙”。处于光子带隙的电磁波无法在光子晶体中传播，若被禁止传播的电磁波处于可见光范围内，则光子晶体明亮的结构色即可被人眼所感知。通过对光子晶体的组成材料、晶格参数、有效折射率等参数进行合理的设计，可以人为调控光子晶体的光子带隙和结构色，使得光子晶体在防伪、喷墨打印、光纤、纺织和传感等领域具有巨大的应用前景。将光子晶体与刺激响应性智能传感材料如水凝胶相结合而成的响应性光子晶体传感器，在智能聚合物传感材料对外界条件如温度、ph、电场、离子强度等产生响应时会发生体积变化，同时引起光子晶体晶格参数变化，使光子带隙发生改变，从而将外界环境的变化转换为可读的光学信号。响应性光子晶体传感器具有成本低廉、制备方便、操作简单、信噪比高、选择性和灵敏性良好等特点，已经可以对蛋白质、碳水化合物、神经毒素、氨基酸和金属离子等进行有效检测。

3、乙酰胆碱酯酶是生物神经传导中的一种关键性酶。这种酶可以在神经突触处将神经递质乙酰胆碱水解为乙酸盐和胆碱。有机磷农药通过不可逆地阻断底物转化来抑制乙酰胆碱酯酶，基于此原理乙酰胆碱酯酶已经被广泛应用于医疗诊断、免疫测定和传感等领域。乙酰胆碱酯酶由633个氨基酸组成，其中有25个赖氨酸，含量较少，因此利用戊二醛直接交联需要大量乙酰胆碱酯酶得到蛋白质凝胶，成本高昂。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术中的不足，提供一种乙酰胆碱酯酶复合水凝胶光子晶体传感器和方法，通过将作为识别分子蛋白质的乙酰胆碱酯酶ache固定在蛋白质牛血清白蛋白bsa中， 使得具有较少游离氨基的乙酰胆碱酯酶ache能够通过交联剂戊二醛ga交联而成复合蛋白质水凝胶以嵌合光子晶体阵列中的胶体颗粒，从而可以利用乙酰胆碱酯酶ache与有机磷农药的特异性结合导致的复合蛋白质水凝胶体积变化和进而导致嵌合其中的胶体颗粒间距变化而能够使光子晶体阵列衍射出的德拜环直径变化，对被测物中的有机磷农药含量实现灵敏无标记可视化检测。

2、本发明的技术解决方案如下：

3、一种乙酰胆碱酯酶复合水凝胶光子晶体传感器，其特征在于，包括乙酰胆碱酯酶复合水凝胶和光子晶体阵列，所述乙酰胆碱酯酶复合水凝胶为片状结构，所述光子晶体阵列中的胶体颗粒以二维排列的方式嵌合在所述片状结构中，所述乙酰胆碱酯酶复合水凝胶为乙酰胆碱酯酶ache与牛血清白蛋白bsa复合并通过戊二醛ga交联而成的复合蛋白质水凝胶。

4、所述复合蛋白质水凝胶中的物质包括以下质量比：ache:bsa:ga=20～40:170:2～5。

5、所述戊二醛ga交联包括戊二醛ga与蛋白质分子表面上的赖氨酸发生席夫碱反应，所述蛋白质分子包括表面上具有25个赖氨酸残基的乙酰胆碱酯酶ache和表面上具有59个赖氨酸残基的牛血清白蛋白bsa。

6、所述光子晶体阵列中的胶体颗粒为聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯或sio2或zns或tio2，所述光子晶体阵列是采用尖端导流气液界面自组装法制备而成。

7、用于检测有机磷农药敌百虫，所述乙酰胆碱酯酶ache具有与敌百虫发生反应使得所述片状光子晶体水凝胶传感器收缩，进而使得所述光子晶体阵列中产生衍射的晶格参数或胶体颗粒的微粒间距发生收缩，利用收缩后的光子晶体阵列所形成的德拜环直径d’与收缩前的光子晶体阵列所形成的德拜环直径d的差值确定被测物中的敌百虫含量，差值越大，敌百虫含量越高。

8、用于检测有机磷农药敌百虫，对被检测物中敌百虫的检测下限为2.132nm，线性检测范围为10-9m～10-5m。

9、用于检测有机磷农药喹硫磷，所述乙酰胆碱酯酶ache与所述喹硫磷发生反应使得所述片状光子晶体水凝胶传感器膨胀，进而使得所述光子晶体阵列中产生衍射的晶格参数或胶体颗粒的微粒间距发生膨胀，利用膨胀前的光子晶体阵列所形成的德拜环直径d与膨胀后的光子晶体阵列所形成的德拜环直径d’’的差值确定被测物中的喹硫磷含量，差值越大，喹硫磷含量越高。

10、用于检测有机磷农药乐果，所述乙酰胆碱酯酶ache与所述乐果发生反应使得所述片状光子晶体水凝胶传感器膨胀，进而使得所述光子晶体阵列中产生衍射的晶格参数或胶体颗粒的微粒间距发生膨胀，利用膨胀前的光子晶体阵列所形成的德拜环直径d与膨胀后的光子晶体阵列所形成的德拜环直径d’’’的差值确定被测物中的乐果含量，差值越大，乐果含量越高。

11、一种乙酰胆碱酯酶复合水凝胶光子晶体传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

12、步骤a，分别制备出光子晶体阵列和复合水凝胶预聚液，所述复合水凝胶预聚液是将乙酰胆碱酯酶ache和牛血清白蛋白bsa溶于三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液tris-hcl中而成，所述光子晶体阵列是采用尖端导流气液界面自组装法制备而成的聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯或sio2或zns或tio2胶体颗粒阵列；

13、步骤b，将所述复合水凝胶预聚液与交联剂戊二醛ga混合成第一混合液，将所述第一混合液铺展在所述光子晶体阵列上进行交联反应以形成将所述光子晶体阵列嵌合其中的复合蛋白质水凝胶，所述复合蛋白质水凝胶中的乙酰胆碱酯酶ache为识别分子蛋白质，所述复合蛋白质水凝胶中的牛血清白蛋白bsa为不干扰识别的固定化基质蛋白质；

14、步骤c，将复合蛋白质水凝胶裁切成具有规格尺寸的片状物即得乙酰胆碱酯酶复合水凝胶光子晶体传感器。

15、所述步骤a中的光子晶体阵列的制备包括以下步骤：

16、步骤a1，合成聚苯乙烯胶体颗粒：在氮气气氛下，将苯乙烯、过硫酸钾和除氧的蒸馏水混合，在搅拌条件下水浴加热反应，反应后通过离心洗涤，制备得到聚苯乙烯胶体颗粒；

17、步骤a2，制备聚苯乙烯二维光子晶体阵列：将聚苯乙烯胶体颗粒分散成乳液，并与正丙醇混合，旋振后注射到水面上，用亲水处理后的载玻片将所述聚苯乙烯胶体颗粒捞出并且在空气中干燥，得到聚苯乙烯二维光子晶体阵列，所述亲水性处理包括将载玻片浸泡在食人鱼溶液中，再用蒸馏水和无水乙醇依次清洗载玻片后用氮气吹干。

18、一种检测有机磷农药敌百虫的方法，其特征在于，使用上述乙酰胆碱酯酶复合水凝胶光子晶体传感器，包括以下步骤：

19、步骤1，准备至少两片乙酰胆碱酯酶复合水凝胶光子晶体传感器，将第一片置于不含有敌百虫的水中，将第二片放入含有敌百虫的待测物中；

20、步骤2，在到达预设时间即同时取出第一片和第二片；

21、步骤3，用激光分别照射第一片和第二片，测量出第一片上光子晶体阵列衍射出的较大德拜环直径d和第二片上光子晶体阵列衍射出的较小德拜环直径d’，根据d与d’的差值确定被测物中的敌百虫浓度。

22、本发明的技术效果如下：本发明一种乙酰胆碱酯酶复合水凝胶光子晶体传感器和方法，通过将作为识别分子蛋白质的乙酰胆碱酯酶ache固定在蛋白质牛血清白蛋白bsa中，使得具有较少游离氨基的乙酰胆碱酯酶ache能够通过交联剂戊二醛ga交联而成复合蛋白质水凝胶以嵌合光子晶体阵列中的胶体颗粒，从而可以利用乙酰胆碱酯酶ache与有机磷农药反应导致的凝胶体积变化和该胶体颗粒间距变化导致的光子晶体阵列衍射出的德拜环直径变化对被测物中的有机磷农药含量实现灵敏无标记可视化检测。

23、本发明提供了一种二维光子晶体乙酰胆碱酯酶复合蛋白质凝胶传感器，该传感器利用牛血清白蛋白作为乙酰胆碱酯酶凝胶化的支架材料，制备了乙酰胆碱酯酶/牛血清白蛋白智能水凝胶，与二维光子晶体集成后，得到二维光子晶体传感器。基于乙酰胆碱酯酶与有机磷农药的反应造成的智能材料体积的变化以及二维光子晶体独特的德拜衍射环，从而实现对有机磷农药的无标记选择性灵敏检测。该传感器原料来源广泛，制备和检测过程操作简单，成本低廉，不需要贵重的仪器设备和专业的操作人员，具有广泛的应用前景，可望制备便携式传感设备，并有望用于食品环境领域残余有机磷农药的检测。

24、本发明具有以下特点：(1)本发明的原料来源丰富，传感器成本低廉，制备流程简单。(2)本发明的检测仪器传感器结构简单，操作简单，具有很好的线性响应性。(3)本发明首次采用有机磷农药诱导的酶催化反应导致的智能材料的体积相变化来检测有机磷。(4)本发明的传感器具有优异的选择性、良好的灵敏度和稳定性。(5)本发明的传感器不具有可逆性。(6)本发明解决了某些蛋白质(酶)分子由于缺少赖氨酸基团无法通过席夫(schiff)碱反应交联制备智能凝胶材料的难题。(7)本发明优化了传感器的性能，通过固定bsa的质量不变，调整ache的质量，发现在ache浓度：bsa＝20:85(w:w)，交联剂单体溶液：5wt％戊二醛＝10:1 (v:v)的条件下传感器发挥最优的性能。(8)本传感器的灵敏度好，检测限：2.132nm，线性检测范围较宽：10-9m～10-5m 。