一种水产品中病原菌的双重PCR检测试剂盒

本发明涉及水产品病原菌检测，更具体地，涉及一种水产品中病原菌的双重pcr检测试剂盒。

背景技术：

1、水产品消费需求的不断增加促使水产养殖业迅猛发展，然而在集约化和高密度养殖的过程中，由致病菌感染引起的水产养殖动物死亡给整个行业带来巨大的经济损失。副溶血性弧菌（vibrio parahemolyticus）和无乳链球菌（streptococcus agalactiae）是水产品中最为常见的两类食源性致病菌，人误食副溶血性弧菌和无乳链球菌引起的食物中毒已经成为世界范围内食源性公共卫生问题之一。建立对这两种病原菌的检测方法显得尤为重要，通过科学的检测手段，水产养殖业可以更有效地适应市场需求，确保可持续发展。

2、目前，对水产品致病菌的诊断手段主要包括生物学方法、免疫诊断法、分子杂交法及pcr法。目前已建立的常规pcr技术是一次只能检测一种病原，而水产养殖动物经常存在致病菌混合感染的现象，给养殖中疾病的防控加大了难度，因此快速有效地单次检测多种病原尤为关键，且尽早检出多种致病菌具有重要的现实意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供了一种水产品中病原菌的双重pcr检测试剂盒。

2、根据本发明的一个方面，提供了一种水产品中病原菌的双重pcr检测试剂盒，包括检测副溶血性弧菌的引物对、检测无乳链球菌的引物对、2×pcr premix和rnase-freewater，检测副溶血性弧菌的引物对为特异性针对副溶血性弧菌的tlh基因，检测无乳链球菌的引物对为特异性针对无乳链球菌的sip基因。

3、在一些实施方式中，检测副溶血性弧菌的引物对包括检测副溶血性弧菌的上游引物和检测副溶血性弧菌的下游引物，检测副溶血性弧菌的上游引物的序列如seq id no.1所示，检测副溶血性弧菌的下游引物的序列如seq id no.2所示。

4、在一些实施方式中，检测无乳链球菌的引物对包括检测无乳链球菌的上游引物和无乳链球菌的下游引物，检测无乳链球菌的上游引物的序列如seq id no.3所示，检测无乳链球菌的下游引物的序列如seq id no.4所示。

5、在一些实施方式中，试剂盒的反应体系为：模板2μl，2×pcr premix 10μl，检测副溶血性弧菌的上游引物和下游引物各0.8μl，检测无乳链球菌的上游引物和下游引物各0.4μl，rnase-free water补足20μl。

6、在一些实施方式中，检测副溶血性弧菌的上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/l，检测无乳链球菌的上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/l。

7、根据本发明的另一个方面，提供了检测试剂盒在制备检测水产品中病原菌的试剂中的应用，病原菌为副溶血性弧菌和无乳链球菌。

8、根据本发明的再一个方面，提供了检测试剂盒的使用方法，方法为非疾病诊断目的的方法，包括以下步骤：

9、s1. dna模板制备：提取待测水产样品的总dna，以其为模板进行后续双重pcr扩增反应；

10、s2. 配制双城pcr扩增反应体系：取待测样本dna模板2μl，加入2×pcr premix 10μl，10μm检测副溶血性弧菌的上游引物和下游引物各0.8μl，10μm检测无乳链球菌的上游引物和下游引物各0.4μl，最后加入rnase-free water补足20μl；

11、s3. 进行双重pcr扩增反应：将上述s2中的混合液离心，进行pcr反应，反应参数为：94℃预变性30s，98℃变性10s，57℃退火30s，72℃延伸1min，运行35个循环，72℃充分延伸2min，最后扩增产物4℃保存；

12、s4. 双重pcr扩增产物检测：pcr反应结束后，用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的预期大小，若发现产物中dna片段出现109bp的特异片段，说明水产样品中含有副溶血性弧菌，若出现269bp的特异片段，说明水产样品中含有无乳链球菌。

13、在一些实施方式中，水产样品为鱼类样品、蟹类样品、贝类样品或虾类样品中的一种或几种。

14、本发明的有益效果：本发明的检测试剂盒利用特异性针对副溶血性弧菌tlh基因和特异性针对无乳链球菌的sip基因的引物，通过单管同步检测，实现可同时鉴别副溶血性弧菌和无乳链球菌两种病原菌，具有灵敏度高，特异性强、操作简便的特点，解决了单次快速有效检测两种病原菌的问题，为水产养殖业的发展起到了促进作用。

技术特征：

1.一种水产品中病原菌的双重pcr检测试剂盒，其特征在于，包括检测副溶血性弧菌的引物对、检测无乳链球菌的引物对、2×pcr premix和rnase-free water，所述检测副溶血性弧菌的引物对为特异性针对副溶血性弧菌的tlh基因，所述检测无乳链球菌的引物对为特异性针对无乳链球菌的sip基因。

2.根据权利要求1所述的一种水产品中病原菌的双重pcr检测试剂盒，其特征在于，所述检测副溶血性弧菌的引物对包括检测副溶血性弧菌的上游引物和检测副溶血性弧菌的下游引物，所述检测副溶血性弧菌的上游引物的序列如seq id no.1所示，所述检测副溶血性弧菌的下游引物的序列如seq id no.2所示。

3.根据权利要求2所述的一种水产品中病原菌的双重pcr检测试剂盒，其特征在于，所述检测无乳链球菌的引物对包括检测无乳链球菌的上游引物和无乳链球菌的下游引物，所述检测无乳链球菌的上游引物的序列如seq id no.3所示，所述检测无乳链球菌的下游引物的序列如seq id no.4所示。

4.根据权利要求3所述的一种水产品中病原菌的双重pcr检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系为：模板2μl，2×pcr premix 10μl，检测副溶血性弧菌的上游引物和下游引物各0.8μl，检测无乳链球菌的上游引物和下游引物各0.4μl，rnase-free water补足20μl。

5.根据权利要求4所述的一种水产品中病原菌的双重pcr检测试剂盒，其特征在于，所述检测副溶血性弧菌的上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/l，所述检测无乳链球菌的上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/l。

6.权利要求1-5任一项所述的检测试剂盒在制备检测水产品中病原菌的试剂中的应用，所述病原菌为副溶血性弧菌和无乳链球菌。

7.权利要求1-5任一项所述的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述方法为非疾病诊断目的的方法，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述水产样品为鱼类样品、蟹类样品、贝类样品或虾类样品中的一种或几种。

技术总结
本发明公开了一种水产品中病原菌的双重PCR检测试剂盒，包括检测副溶血性弧菌的引物对、检测无乳链球菌的引物对、2×PCR PreMix和RNase‑free Water，检测副溶血性弧菌的引物对为特异性针对副溶血性弧菌的Tlh基因，检测无乳链球菌的引物对为特异性针对无乳链球菌的Sip基因。本发明的检测试剂盒利用特异性针对副溶血性弧菌Tlh基因和特异性针对无乳链球菌的Sip基因的引物，通过单管同步检测，实现可同时鉴别副溶血性弧菌和无乳链球菌两种病原菌，具有灵敏度高，特异性强、操作简便的特点，解决了单次快速有效检测两种病原菌的问题，为水产养殖业的发展起到了促进作用。

技术研发人员：许媛媛,苗晋锋,扶绍东,胡亚琦,易璇
受保护的技术使用者：南京农业大学三亚研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/2/21