一种检测非洲猪瘟病毒的体系、构建方法、试剂盒与流程

本发明涉及基因工程，尤其涉及一种检测非洲猪瘟病毒的体系、构建方法、试剂盒。

背景技术：

1、非洲猪瘟(african swine fever，asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fevervirus，asfv)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，发病时间短，死亡率高，是对养猪业危害最为严重的疫病。afsv是一种双链dna病毒，二十面体形态，具有囊膜和独特的多层结构，是非洲猪瘟病毒属的唯一成员。asfv强毒株感染后引起急性临床症状，表现为呕吐，腹泻，脾脏肿大，淋巴结出血等典型症状。目前针对asf尚无可用的疫苗及治疗药物，因此asfv的早期诊断对非洲猪瘟的防控至关重要。

2、目前针对asfv的分子生物学检测方法主要包括普通pcr以及荧光定量p cr。然而这两种方法具有一定的局限性，一方面这两种检测方法都需要较长的检测时间，过程繁琐，另一方面需要在特定的实验室进行操作，而且实验仪器昂贵，不适用于生产一线。基于目前asf的现实情况，更需要一种实验仪器简单，操作简便的生产一线检测方法。

3、jennifer a.doudna团队首次提出将crispr-cas12a应用于核酸检测技术。该研究发现当cas12a与crrna以及靶标dna形成复合物时，可以对附近的任何单链dna进行切割。根据此研究发现在检测时加入带有荧光信号标记的单链dna，当crispr-cas12a系统发挥非特异性切割活性时，带有荧光信号标记的单链dna中的荧光基团和猝灭基团被切断，从而发出肉眼可见的荧光。

4、中国专利201911098281.8申请公开了一种非洲猪瘟病毒vp72和cd2v基因的双重实时荧光检测引物探针组、试剂盒及方法，该方案针对vp72基因，设计了正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中特异性荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；

5、进一步观察该方案的说明书可见，该方案中的针对vp72设计的正向引物的核苷酸序列为ataaagcgctcgccgaaggga，反向引物的核苷酸序列为tac agctgtaatggacctcaa，特异性荧光探针的核苷酸序列为fam-ataccga gggaatagcaaggttcacgtt-bhq1，并且通过实施例可见，该方案的检测方法具体是基于pcr设计的方法。

6、中国专利申请202210483183.1公开了一种基于cas12a蛋白的阪崎肠杆菌检测方法及其应用采用由阪崎肠杆菌rpob基因设计得到的rpa扩增引物组，在等温条件下利用cas12a蛋白、crrna、dna报告分子和所述rpa扩增引物组检测阪崎肠杆菌，具体包括如下步骤：

7、s1、制备cas12蛋白；

8、s2、根据保守的阪崎肠杆菌rpob基因设计rpa扩增引物组，所述rpa扩增引物组经ncbi-blast比对显示，为特异的阪崎肠杆菌序列；

9、s3、基于cas12a蛋白的特点，将扩增的基因片段序列设计为能够特异识别阪崎肠杆菌的crrna，所述crrna经ncbi-blast比对显示，为特异的rpob基因序列；

10、s4、基于cas12a蛋白的特点，构建dna报告分子；

11、s5、将如步骤s2所述的阪崎肠杆菌rpob基因中的vp72基因的核酸序列克隆至puc57质粒中，培养、提取得到阳性质粒(含有阪崎肠杆菌dna片段的质粒)；

12、s6、将步骤s5得到的阳性质粒制备成标准工作品，并将所述标准工作品加入扩增检测体系中，混合均匀后恒温反应15分钟，得到反应产物；

13、s7、将步骤s6得到的反应产物配制成crispr-cas12a检测体系，再将所述crispr-cas12a检测体系放入常温等温扩增荧光检测仪中恒温反应时间60分钟，得到检测结果。

14、观察该方案的步骤2可见，该方案的步骤2中使用rpa扩增技术对样品进行扩增。

15、本方案需要解决的问题：如何提供一种基于crispr cas12a检测非洲猪瘟病毒的体系，并且缩短检测耗时。

技术实现思路

1、本技术的目的是以提供一种基于crispr cas12a检测非洲猪瘟病毒的体系，所述基于crispr cas12a检测非洲猪瘟病毒的体系包含cas12a蛋白和crrna，所述crrna通过靶标序列pam序列后的20-23bp的靶点序列设计得到，所述crrna的核苷酸序列如seq id no.1所示；

2、所述lamp引物组是针对asfv衣壳蛋白vp72编码基因设计得到的；

3、所述靶标序列为lamp引物组对asfv衣壳蛋白vp72编码基因扩增得到的扩增产物序列。

4、优选地，所述lamp引物组包括asfv-f3、asfv-b3、asfv-fip、asfv-bip；

5、所述asfv-f3的核苷酸序列如seq id no.2所示；

6、所述asfv-b3的核苷酸序列如seq id no.3所示；

7、所述asfv-fip的核苷酸序列如seq id no.4所示；

8、所述asfv-bip的核苷酸序列如seq id no.5所示。

9、此外，本技术还公开了一种基于crispr cas12a检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，包含上述的基于crispr cas12a检测非洲猪瘟病毒的体系。

10、优选地，所述基于crispr cas12a检测非洲猪瘟病毒的试剂盒具体包括1μl浓度为1μm/μl的lbcas12a，1μl的10×buffer，1μl浓度为1μm/μl的crrna，1μl的fq-labeledreporter，1μl的lamp扩增产物，5μl的ddh2o。

11、此外，本技术还公开了一种用于构建上述的基于crispr cas12a检测非洲猪瘟病毒的体系的构建方法，包括以下步骤：

12、步骤1：根据asfv衣壳蛋白vp72编码基因设计得到lamp引物组；

13、步骤2：使用lamp引物组对含有vp72编码基因的质粒扩增，得到扩增产物；

14、步骤3：以步骤2制得的扩增产物为靶标序列，并根据靶标序列后的20-23bp的靶点序列设计得到crrna；

15、步骤4：将crispr cas12a、crrna混合，得到基于crispr cas12a检测非洲猪瘟病毒的体系。

16、本技术的有益效果是：本技术所公开的检测非洲猪瘟病毒的体系是基于crisprcas12a技术设计得到的，其具有良好的特异性，在该技术中，只有特定的crrna和目标靶基因同时存在时，crrna才能够顺利的引导cas12a对带有荧光信号标记的单链dna中的荧光基团和猝灭基团进行剪切并散发荧光，另一方面，本技术所用到的扩增技术并非现有技术所公开的pcr或rpa检测技术，而lamp检测技术因其扩增过程的高效性能够在一定程度上缩短扩增过程的耗时，同时，需要说明的是，本技术对crrna的选取也是十分重要的，首先，我们挑选了目标基因中保守性较高的基因片段，同时，由于cas12中的胸腺嘧啶(t)占比较高，因此，我们对应的选择了尿嘧啶(u)含量较高的基因片段作为crrna，以此增强crrna对cas12的引导能力，因此，本技术对crrna的选取是十分重要的，其不仅选自目标基因中保守性较高的基因片段，同时具有相对较高的尿嘧啶(u)含量，而此选择一方面能够降低误检的风险，另一方面也提升了检测的效率。