用于检测新型冠状病毒的LAMP检测引物和探针组合、试剂盒及检测方法与流程

本发明属于分子生物学领域，具体涉及采用环介导等温扩增技术检测新型冠状病毒。

背景技术：

1、环介导恒温扩增技术(1oop mediated isothermal amplification，lamp)是一种新型恒温核酸扩增方法，针对靶基因的6个区域设计4-6条特异引物，利用一种链置换dna聚合酶(bst dna polymerase)在60-65℃反应15-60分钟即可实现109～1010倍的核酸扩增，具有快速、简便、敏感性高、特异性强等特点，已在食品安全、微生物检验、临床诊断等方面得到了广泛应用。

2、lamp结果判读主要采用观测焦磷酸镁白色沉淀、hnb染料颜色、钙黄绿素荧光等方法，可通过目测或仪器直接判定检测结果。在这些方法中，阳性检测结果只能表明实验过程中发生了lamp反应，但无法区分真正的由引物和目标dna之间杂交形成的阳性扩增结果，以及由引物之间、引物与样本dna之间误杂交、误扩增导致的假阳性扩增结果，给临床检测等造成了不便。

3、近些年，lamp检测演化出多种探针法，实现方式为高保真酶酶切、核酸酶酶切和茎环结构(分子信标、蝎子探针、杂交探针)等，需要在体系中加入高保真酶或rnase h进行探针切割收集荧光，或是在探针设计时增加互补区域或互补引物实现荧光淬灭，发生链置换后收集荧光。lamp探针法提高了检测的特异性、便捷性，同时也使lamp多重检测成为了可能。

4、分子信标、蝎子探针、杂交探针，这三种方法的双标记探针需要形成二级结构(例如发夹、环、互补双链等)，实现荧光基团与淬灭基团之间的相互作用。二级结构的出现，使得探针设计难度增加，很大程度的限制了引物设计区域及探针序列的选择，同时杂交探针还会增加检测的操作难度。

5、高保真法和酶切法探针是在现有的taqman探针设计的基础上进行的优化，高保真法探针设计难度不大，需要在反应体系中增加高保真酶，酶切法探针体系中需要额外增加rnase hⅱ，同时在探针序列中引入核糖核苷酸，使得这两种探针设计方法的检测成本和操作难度都有所增加。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于检测新型冠状病毒的lamp检测引物和探针组合，在检测新型冠状病毒时无需增加额外试剂，特异性好，灵敏度高，操作简单，成本低廉。

2、为了实现上述目标，本发明采用如下技术方案：

3、一种用于检测新型冠状病毒的lamp检测引物和探针组合，包括：

4、f3：acaagctttcggcagacg

5、b3：tcatccaatttgatggcacc

6、fip：gtgcaatttgcggccaatgtttttaggaaattttggggaccaggbip：ccagcgcttcagcgttcttcttttgtaggtcaaccacgttcc

7、lf：aatcagttccttgtctgattagttcc

8、lb：gtcgcgcattggcatgg

9、探针lp：5’-bhq1-gtcgcgcattggca/int-6-fam-dt/gg

10、其中，bhq1为淬灭基团，标记在5’末端的g碱基上，6-fam为荧光基团，标记在3’端的t碱基上，具体结构为：

11、

12、上述式中，q为bhq1的简写，f为6-fam的简写。

13、本发明还提供了上述引物和探针组合在制备用于检测新型冠状病毒的试剂盒中的应用。

14、本发明还提供了一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒，含有上述引物和探针组合。优选地，所述试剂盒进一步含有bst dna聚合酶、耐热反转录酶；更优选地，所述试剂盒进一步含有缓冲液、kcl、(nh4)2so4、mgso4、dntps、tween20、双蒸水；更优选地，所述试剂盒进一步含有阳性对照；更优选地，所述试剂盒进一步含有阴性对照；更优选地，所述试剂盒进一步含有核酸提取试剂。

15、优选地，bst dna聚合酶选自bst dna聚合酶(大片段)、bst dna聚合酶2.0、bstdna聚合酶3.0、bst dna聚合酶4.0等。

16、优选地，耐热反转录酶选自amv反转录酶、rtx反转录酶等。

17、本领域技术人员可以理解，本领域各种缓冲液都可以用于本发明。优选地，缓冲液选自tris-hcl缓冲液、tris-硼酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液等。

18、优选地，所述阳性对照为新型冠状病毒n基因的假病毒核酸。

19、优选地，所述阴性对照为双蒸水。

20、本领域技术人员可以理解，本领域常用的核酸提取试剂都可以用于本发明。

21、在一个优选的实施方案中，本发明的试剂盒含有：独立包装的缓冲液混合物，其含有50-250mm tris-hcl(ph 8.8)缓冲液、50-400mm kcl、25-100mm(nh4)2so4、25-50mmmgso4、2.5-12.5mm dntps、0.05-5％ tween 20、0.5-3μm的正向外引物f3、0.5-3μm的反向外引物b3、4-10μm的正向内引物fip、4-10μm的正向内引物bip、2.5-12μm的正向环引物lf、2.5-12μm的反向环引物lb和0.2-4μm的探针lp；独立包装的8u/μl bst dna聚合酶；独立包装的10u/μl耐热反转录酶；以及独立包装的双蒸水。

22、在一个优选的实施方案中，本发明的试剂盒含有：独立包装的缓冲液混合物，其含有150mm tris-hcl(ph 8.8)缓冲液、130mm kcl、50mm(nh4)2so4、35mm mgso4、7mm dntps、0.5％ tween 20、1μm的正向外引物f3、1μm的反向外引物b3、8μm的正向内引物fip、8μm的正向内引物bip、4μm的正向环引物lf、4μm的反向环引物lb和0.4μm的探针lp；独立包装的8u/μl bst dna聚合酶(大片段)；独立包装的10u/μl amv反转录酶；以及独立包装的双蒸水。

23、在一个优选的实施方案中，本发明的试剂盒以检测一人次计含有：独立包装的缓冲液混合物5μl，其由150mm tris-hcl(ph 8.8)缓冲液、130mm kcl、50mm(nh4)2so4、35mmmgso4、7mm dntps、0.5％ tween 20、1μm的正向外引物f3、1μm的反向外引物b3、8μm的正向内引物fip、8μm的正向内引物bip、4μm的正向环引物lf、4μm的反向环引物lb和0.4μm的探针lp组成；独立包装的8u/μl bst dna聚合酶(大片段)1μl；独立包装的10u/μl amv反转录酶0.2μl；以及独立包装的双蒸水8.8μl。

24、本发明还涉及使用本发明的试剂盒进行核酸检测的方法，包括如下步骤：

25、1.使用核酸提取试剂对新型冠状病毒的核酸进行提取；

26、2.将缓冲液混合物、bst dna聚合酶、耐热反转录酶以及双蒸水混合；

27、3.将步骤1所提取核酸提取物加入到步骤2所得混合液中得反应体系；

28、4.将反应体系于恒温例如50-70℃扩增例如10-60min，使用例如荧光pcr仪进行检测。

29、在一个优选的实施方案中，反应体系中含有30mm tris-hcl、26mm kcl、10mm(nh4)2so4、7mm mgso4、1.4mm dntps、0.1％ tween 20、0.2μm的正向外引物f3、0.2μm的反向外引物b3、1.6μm的正向内引物fip、1.6μm的正向内引物bip、0.8μm的正向环引物lf、0.8μm的反向环引物lb、0.08μm的探针lp、8u bst dna聚合酶(大片段)、2u amv反转录酶、核酸提取物以及双蒸水。

30、本发明的用于检测新型冠状病毒的lamp检测引物和探针组合，在检测新型冠状病毒时无需增加额外试剂，特异性好，灵敏度高，操作简单，成本低廉。