一种脂肪酶突变体及其应用

本发明属于生物，具体涉及一种脂肪酶突变体及其应用。

背景技术：

1、脂肪酶(lipase，triacylglycerol acylhydrolases，e.c.3.1.1.3)，又称为三酰甘油水解酶。它主要在油水界面催化脂肪和油脂的水解反应，将它们分解成脂肪酸、二酰甘油、一酰甘油和甘油。由于其能在温和条件下操作、具有广泛的底物特异性和在有机溶剂中的稳定性，脂肪酶在工业中广泛应用于食品、洗涤剂、制药、皮革、纺织、化妆品、纸张等领域。

2、脂肪酶在自然环境中广泛分布，可以从动物、植物和微生物中获得。其中，微生物来源脂肪酶在工业应用中占据关键地位，因为它们易于操作、供应丰富，而且催化性能出色，适合于工业化大规模生产和获得高纯度样品。用于生产脂肪酶的细菌来源包括芽孢杆菌属、不动杆菌属、假单胞菌属等；真菌来源包括青霉菌属、镰刀菌属、曲霉菌属等。

3、脂肪酶表现出显著的底物链长特异性，即对不同链长的甘油三酯底物表现出选择性，这使得脂肪酶在合成和加工中具有广泛的应用。例如在生物燃料的生产中，脂肪酶可以选择特定链长的脂肪酸，有助于提高生物燃料的产量和质量。同时，脂肪酶还表现出位置选择性，能够对甘油三酯中特定的酯键优先水解，位置选择性可以是sn-1(3)或sn-2位，该性能在食品工业中尤为关键。立体选择性是指脂肪酶在催化过程中对底物分子的立体结构具有选择性，在手性分子的合成中非常重要(j.-y.park and k.-m.park,‘lipase and itsunique selectivity:a mini-review’,journal of chemistry,vol.2022,p.e7609019,oct.2022,doi:10.1155/2022/7609019.)。

4、甘油三酯在工业上具有广泛的价值，其水解产生的游离脂肪酸和甘油在生物燃料、食品、医药和化妆品制备以及可持续化学品生产等领域具有广泛的应用，同时，水解产生的结构二酯在一些特定领域如生物材料、食品行业等也具有潜在的应用(m.k.ghide andy.yan,‘1,3-dioleoyl-2-palmitoyl glycerol(opo)—enzymatic synthesis and use asan important supplement in infant formulas’,j food biochem,vol.45,no.7,p.e13799,2021,doi:10.1111/jfbc.13799.)。

5、然而，一些传统脂肪酶在对不同链长和饱和度的甘油三酯进行水解时，可能存在底物特异性差、游离脂肪酶稳定性差、需要昂贵的辅助剂等问题(z.l.wei zi-xiang,‘improving the activity and thermal stability of thermomyces lanuginosuslipase by rational design’,china biotechnology,vol.41,no.2/3,pp.63–69,apr.2021,doi:10.13523/j.cb.2011036.)。因此通过基因挖掘新型脂肪酶，可以寻找对特定长链甘油三酯更具特异性的脂肪酶，得到活性和稳定性更优良的酶，提高水解反应的效率，降低生产成本，对于大规模的应用具有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种新型的脂肪酶突变体。

2、本发明首先提供了一种脂肪酶突变体，由氨基酸序列如seq id no.1所示的野生型脂肪酶突变而得，突变的方式为：l7c/a386c/a174c/a243c、l7c/a386c/l108c/h159c、l7c/a386c、a174c/a243c、l108c/h159c、a174c/a243c/t163c/s166c/l7c/a386c、a174c/a243c/t163c/s166c、l7c/a386c/t163c/s166c、t163c/s166c中的任意一种。

3、其中，l7c表示7位赖氨酸突变为半胱氨酸。a386c表示386位丙氨酸突变为半胱氨酸。a174c表示174位丙氨酸突变为半胱氨酸。a243c表示243位丙氨酸突变为半胱氨酸。l108c表示108位赖氨酸突变为半胱氨酸。h159c表示159位组氨酸突变为半胱氨酸。t163c表示163位苏氨酸突变为半胱氨酸。s166c表示166为丝氨酸突变为半胱氨酸。

4、本发明又提供了编码所述脂肪酶突变体的基因。

5、本发明又提供了一种重组表达载体，包含所述基因。

6、本发明又提供了一种基因工程菌，包括宿主细胞和导入的外源基因，所述外源基因为所述基因。

7、优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)、bl21(de3)star、t7、tssetta、bl21(de3)plyss、origamitm 2和bl21(de3)laclg中任一种。

8、优选的，宿主细胞中还导入有用于表达分子伴侣蛋白的基因。

9、本发明又提供了所述脂肪酶突变体，或者所述基因工程菌在水解甘油三酯中的应用。优选的，所述甘油三酯为以下至少一种：三乙酸甘油酯、三丁酸甘油酯、三己酸甘油酯、三辛酸甘油酯、三癸酸甘油酯、甘油三月桂酸酯、甘油三肉豆蔻酸酯、甘油三棕榈酸酯、甘油三油酸酯。

10、本发明还提供了一种水解甘油三脂的方法，利用催化剂催化水解甘油三脂，所述催化剂为以下至少一种：所述脂肪酶突变体，包含所述基因工程菌的全细胞或湿菌体，所述基因工程菌经培养后细胞破碎所得的粗酶液。优选的，所述甘油三酯为以下至少一种：三乙酸甘油酯、三丁酸甘油酯、三己酸甘油酯、三辛酸甘油酯、三癸酸甘油酯、甘油三月桂酸酯、甘油三肉豆蔻酸酯、甘油三棕榈酸酯、甘油三油酸酯。

11、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

12、本发明通过基因挖掘获得了1株未被报道的新型高酶活性脂肪酶，通过优化表达宿主以及添加分子伴侣的方式进一步提高了脂肪酶的酶活性以及蛋白可溶性表达水平。本发明来源于类芽孢杆菌幼虫属的脂肪酶，能够水解一系列的甘油三酯类化合物，尤其具备卓越的催化长链甘油三酯的能力，最高酶活可达24.56u/ml。在此基础上，通过定点突变技术，获得了脂肪酶突变体，其中酶活提升的最优突变体的粗酶活较野生型提高了3.63倍，而热稳定性提升的最优突变体在55℃下保温30min的残余酶活较野生型提高了3.03倍。本发明不仅挖掘了高酶活性的新型脂肪酶基因，而且通过蛋白质工程，显著提升了酶的功能特性，为脂肪酶在工业生产上的广泛应用提供了更有竞争力的解决方案。

技术特征：

1.一种脂肪酶突变体，其特征在于，由氨基酸序列如seq id no.1所示的野生型脂肪酶突变而得，突变的方式为：l7c/a386c/a174c/a243c、

2.编码权利要求1所述脂肪酶突变体的基因。

3.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求2所述基因。

4.一种基因工程菌，其特征在于，包括宿主细胞和导入的外源基因，所述外源基因为权利要求2所述基因。

5.根据权利要求4所述基因工程菌，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)、bl21(de3)star、t7、tssetta、bl21(de3)plyss、origamitm 2和bl21(de3)laclg中任一种。

6.根据权利要求4所述基因工程菌，其特征在于，宿主细胞中还导入有用于表达分子伴侣蛋白的基因。

7.权利要求1所述脂肪酶突变体，或者权利要求4～6任一所述基因工程菌在水解甘油三酯中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述甘油三酯为以下至少一种：三乙酸甘油酯、三丁酸甘油酯、三己酸甘油酯、三辛酸甘油酯、三癸酸甘油酯、甘油三月桂酸酯、甘油三肉豆蔻酸酯、甘油三棕榈酸酯、甘油三油酸酯。

9.一种水解甘油三脂的方法，其特征在于，利用催化剂催化水解甘油三脂，所述催化剂为以下至少一种：权利要求1所述脂肪酶突变体，包含权利要求4～6任一所述基因工程菌的全细胞或湿菌体，权利要求4～6任一所述基因工程菌经培养后细胞破碎所得的粗酶液。

10.根据权利要求9所述水解甘油三脂的方法，其特征在于，所述甘油三酯为以下至少一种：三乙酸甘油酯、三丁酸甘油酯、三己酸甘油酯、三辛酸甘油酯、三癸酸甘油酯、甘油三月桂酸酯、甘油三肉豆蔻酸酯、甘油三棕榈酸酯、甘油三油酸酯。

技术总结
本发明公开了一种脂肪酶突变体及其应用，所述脂肪酶突变体由来自于一种类芽孢杆菌幼虫属生物的野生型脂肪酶突变而得，其中酶活提升的最优突变体的粗酶活较野生型提高了3.63倍，而热稳定性提升的最优突变体在55℃下保温30min的残余酶活较野生型提高了3.03倍。本发明不仅挖掘了高酶活性的新型脂肪酶基因，而且通过蛋白质工程，显著提升了酶的功能特性，为脂肪酶在工业生产上的广泛应用提供了更有竞争力的解决方案。

技术研发人员：杨立荣,卢梦瑶,王子渊,徐佳琪,吴坚平
受保护的技术使用者：浙江大学杭州国际科创中心
技术研发日：
技术公布日：2024/5/10