一种腐植酸-铋纳米材料的制备及其应用

本发明属于药物化学，尤其涉及一种腐植酸-铋纳米材料的制备及其应用。

背景技术：

1、炎症性肠病(ibd，inflammatory bowel disease)主要包括溃疡性结肠炎(uc，ulcerative colitis)和克罗恩氏病(cd，crohn’s disease)，是胃肠道最常见的慢性炎症性疾病，并且也是一种难治性自身免疫疾病。根据炎症的严重程度和发生的位置，ibd症状可能从腹泻、便血或意外体重减轻到并发症，包括肠穿孔、肠梗阻和肠癌等。传统的诊断方式依赖于肠镜等侵入式的检测方法，对患者造成极大的痛苦，更重要的是难以实现早期诊断。此外，临床上ibd的治疗手段主要包括非靶向疗法(如氨基水杨酸盐、糖皮质激素和免疫调节剂)和靶向生物疗法(如抗tnf制剂)，难以精确控制用药剂量，导致药物摄入不足或过量，不能治愈疾病。因此，发展ibd诊疗的新技术、新方法，将为其综合防治提供有效依据至关重要。

2、腐植酸(has,humic acid)是一种富含羟基、羧基和其他基团的大分子有机物质，由植物和微生物残留物通过腐殖化作用形成。在中医中，has自1786年以来一直被称为乌金散。众多医学名著和医药学家都对其进行了详细记载和论述。李时珍在《本草纲目》中己有关于腐植酸药用的记载，主要用以治疗鼻子出血、妇女气血痛、心腹痛等许多病。近年来，腐植酸在肿瘤消融、细菌感染、脑缺血等领域的应用被广泛报道，这些发现预示着腐植酸作为组织修复治疗剂的巨大潜力，特别是在细菌感染的伤口愈合方面。然而，腐植酸在炎性肠病方面的应用鲜有报道。此外，腐植酸的溶解度依赖于ph值，制约了腐植酸的应用和药效发挥。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提出了一种腐植酸-铋(biha,humic acid-bi)纳米材料的制备及其应用。本发明的腐植酸-铋纳米材料可以成功地通过胃和小肠，从而富集在结肠炎症部位，将biha纳米材料通过共价偶联荧光染料cy5.5后，可以选择性地可视化ibd病变。此外，biha纳米材料具有较高的ros清除能力，加快溃疡面的愈合。

2、为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明的技术方案之一：

4、一种腐植酸-铋纳米材料的制备方法，包括以下步骤：

5、在腐植酸溶液中滴加铋的可溶性酸性溶液；

6、加入三价铁，纯化，离心，得到的沉淀冷冻、真空干燥得到腐植酸-铋纳米材料。

7、进一步的，腐植酸的重均分子量为3000-50000。

8、更进一步的，腐植酸的重均分子量为20000-50000。

9、进一步的，腐植酸溶液与铋的可溶性酸性溶液的质量比为(0.5∶1)-(5∶1)。

10、进一步的，腐植酸溶液的浓度为2-5％(w/v)。

11、进一步的，铋的可溶性酸性溶液的配制方法为：将50mg bi(no3)3·5h2o加入到1.0-2.0ml hno3溶液(2m)中，待充分溶解，得到铋的可溶性酸性溶液。

12、进一步的，所述三价铁为fecl3·6h2o。

13、更进一步的，腐植酸-铋纳米材料的制备方法，具体包括以下步骤：

14、1.取200mg腐植酸(mw＝3000-50000)溶解于8.0ml水中，得到腐植酸溶液，室温搅拌，将50mg bi(no3)3·5h2o加入到1.0 -2.0ml hno3溶液(2m)中，待充分溶解，将其滴加到上述腐植酸溶液中，室温搅拌30 -60min；

15、2.加入30mg的fecl3·6h2o搅拌12-18h，将得到的bi-ha用dd h2o透析法进一步纯化24h，去除多余的反应物；

16、3.24h后取出，以14000g的离心力离心5min，弃去上清，沉淀放入-80℃冷冻6h，真空冷冻干燥过夜，最终得到biha纳米材料，其为均匀的biha纳米颗粒。

17、本发明通过水热法制备了一种腐植酸-铋纳米材料，该纳米材料可以成功地通过胃和小肠，从而富集在结肠的炎症部位，将腐植酸-铋纳米材料通过共价偶联荧光染料cy5.5后，可以选择性地可视化ibd病变。此外，腐植酸-铋纳米材料具有较高的ros清除能力，加快溃疡面的愈合。

18、本发明的技术方案之二：

19、一种由上述方法制备的腐植酸-铋纳米材料，其为均匀的颗粒，呈方形、类球形、球形或三角形，粒径为120-600nm。

20、本发明的腐植酸-铋纳米材料，由于腐植酸分子量的不同，会导致制备的颗粒的粒径大小和均一性会有所差异。例如，当腐植酸mw＝20000-50000时，制备的纳米颗粒粒径大多分布在120-150nm之间；当腐植酸的mw＝3000-10000时，制备的纳米颗粒粒径大多分布在400-600nm之间；当腐植酸的mw＝10000-30000时，制备的纳米颗粒粒径大多分布在300-600nm之间。

21、本发明的技术方案之三：

22、所述的腐植酸-铋纳米材料在制备治疗氧自由基损伤相关疾病药物中的应用。

23、本发明的技术方案之四：

24、所述的腐植酸-铋纳米材料在制备治疗炎性肠病药物中的应用，通过抑制il-6、il-1β和tnf-α炎症因子的表达治疗炎性肠病。

25、本发明的技术方案之五：

26、所述的腐植酸-铋纳米材料在制备小分子载体药物或者核酸载体药物中的应用。

27、本发明提供一种腐植酸-铋纳米材料，其可用于治疗线粒体损伤、治疗炎性肠病、作为递送小分子或核酸载体，尤其是可以针对溃疡性结肠炎进行诊疗一体化。本发明首次提出腐植酸-铋纳米材料可以用于炎性结肠炎诊疗一体化，本发明首次将该纳米材料应用于炎性结肠炎的诊断和治疗领域，该纳米制剂对dss诱导的小鼠产生的结肠炎具有很好的诊断和治疗效果。

28、与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：

29、1、通过一步法水热法合成的腐植酸-铋纳米制剂，通过透射电镜和mapping分析得出，制备的纳米颗粒为120-150nm的球状结构。通过细胞毒性实验和溶血实验，证明该纳米材料的安全性良好。将腐植酸-铋纳米制剂通过化学偶联cy5.5荧光分子后，口服该纳米材料，通过小动物活体成像及离体成像发现，腐植酸-铋纳米制剂主要富集到小鼠的结肠的炎症部位。以上结果提示，该纳米材料可以作为一种结肠炎的靶向诊断试剂。

30、2、将腐植酸-铋纳米材料与罗丹明b分子共孵育后，离心纯化处理，与raw264.7细胞共孵育，在共聚焦显微镜下观察发现，腐植酸-铋纳米材料能够很好的负载罗丹明b进入到细胞中，表明腐植酸-铋具有递送小分子染料或核酸的潜力；将腐植酸-铋纳米材料与荧光分子cy3的标记sirna共孵育6h后，再与a549细胞共孵育，在共聚焦显微镜下观察发现，biha能够携带sirna进入a549细胞，表明biha纳米颗粒具有作为核酸载体的潜力。

31、3、以脂多糖(lps)构建体外炎症模型，通过荧光定量pcr技术分别检测正常对照组、lps刺激组、lps刺激+腐植酸-铋组的raw264.7细胞的il-6、il-1β及tnf-α的表达水平，结果显示biha纳米颗粒+lps组raw264.7细胞中炎症因子il-6、il-1β、tnf-α的mrna相对表达量比lps刺激组降低，且具有显著差异(p＜0.05)，以上说明biha纳米颗粒可以抑制细胞炎症。

32、4、通过试管内ros测定及细胞ros测定评估腐植酸-铋纳米材料清除活性氧ros能力，结果表明，腐植酸-铋纳米材料具有很好的清除细胞内ros的能力；通过线粒体膜电位检测技术评估腐植酸-铋纳米对线粒体的影响，结果表明，腐植酸-铋纳米能够修复炎症引起的线粒体损伤。

33、5、通过dss诱导慢性结肠炎小鼠，将腐植酸-铋纳米材料对结肠炎小鼠进行灌胃治疗。分别计算疾病活动得分(dai)、测量结肠长度、检测结肠组织mpo、实时荧光定量pcr检测小鼠结肠组织炎症因子的il-6、il-1β、tnf-α表达水平及通过结肠组织he染色评估结肠组织受损情况，结果表明腐植酸-铋纳米材料能够缓解dss诱导的小鼠溃疡性结肠炎。