家蚕中敲除SPI51基因表达在制备提高蚕茧对真菌抑菌能力中的应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，具体涉及家蚕中敲除spi51基因表达在制备提高蚕茧对真菌抑菌能力中的应用。

背景技术：

1、蚕茧是由丝纤维组成的，是蛹的保护层。它有多层结构来保护蛹；它还具有优异的力学性能。在蚕茧中也发现了多种抑菌蛋白，可以有效抑制真菌和细菌的生长速度。蚕茧中的主要抗菌物质是蛋白酶抑制剂和seroins蛋白，蚕茧中的蛋白酶抑制剂和seroins蛋白大概共有十几种。有很多研究表明，每一种抗菌蛋白针对的微生物都有所不同。因此，蚕茧抗菌能力的强弱与抗菌物质的含量以及种类有很大的关系。因此，通过基因工程，改变蚕茧中抗菌物质的种类及含量，提高蚕茧对真菌抑菌能力，能够有效解决目前真菌类耐药性的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种家蚕中敲除spi51基因表达在制备提高蚕茧对真菌抑菌能力中的应用；本发明的目的之二在于提供提高家蚕蚕茧对真菌抑菌能力的方法。

2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、1、家蚕中敲除spi51基因表达在制备提高蚕茧对真菌抑菌能力中的应用，所述敲除spi51基因表达使用敲除spi51基因的家蚕双元转基因系统，所述系统包括基于piggybac的cas9表达载体和靶标spi51基因的sgrna表达载体。

4、本发明优选的，所述sgrna的位点序列如seq id no.1所示。

5、本发明优选的，所述sgrna表达载体由以下方法制备：将seq id no.2和seq idno.3所示核苷酸序列退火形成双链连入grna表达载体，然后将u6-grna-ttttt替换pbac[u6-grna-glmn,3xp3-egfp]载体上的pu6-glmn-grna scaffold-t6获得sgrna表达载体。

6、本发明优选的，所述真菌为酿酒酵母。

7、2、提高家蚕蚕茧对真菌抑菌能力的方法，通过在家蚕中敲除spi51基因，筛选纯合突变个体，获得抑制真菌能力好的家蚕品种。

8、本发明优选的，所述敲除spi51基因表达的方法是通过zfns、talens和crispr/cas9或其变体介导靶标spi51基因敲除。

9、本发明优选的，所述敲除spi51基因表达的方法是通过crispr/cas9介导敲除家蚕spi51基因。

10、本发明优选的，所述crispr/cas9介导敲除家蚕spi51基因由cas9表达载体与靶标spi51基因的sgrna的双元转基因系统介导。

11、本发明优选的，所述靶标spi51基因的sgrna由seq id no.2和seq id no.3所示核苷酸序列退火形成双链。

12、本发明优选的，制备cas9转基因家蚕；然后构建靶标spi51基因的sgrna表达载体，并制备sgrna转基因家蚕；将sgrna转基因家蚕和cas9转基因家蚕进行杂交、荧光筛选不可再继续产生编辑的个体进行pcr分型检测，筛选到杂合体，杂合体自交，经过对突变序列的分型检测及克隆测序鉴定出后代中的纯合突变个体，获得家蚕纯裸蛹品种。

13、本发明的有益效果在于：本发明公开了家蚕中敲除spi51基因表达在制备提高蚕茧对真菌抑菌能力中的应用，本发明通过使用基因工程技术将家蚕中spi51基因敲除，获得spi51基因功能缺陷的家蚕品系，获得的家蚕结茧后能够提高蚕丝的真菌的抑菌能力，能够有效解决目前真菌类耐药性的问题。

技术特征：

1.家蚕中敲除spi51基因表达在制备提高蚕茧对真菌抑菌能力中的应用，其特征在于：所述敲除spi51基因表达使用敲除spi51基因的家蚕双元转基因系统，所述系统包括基于piggybac的cas9表达载体和靶标spi51基因的sgrna表达载体。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述sgrna的位点序列如seq id no.1所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述sgrna表达载体由以下方法制备：将seq id no.2和seq id no.3所示核苷酸序列退火形成双链连入grna表达载体，然后将u6-grna-ttttt替换pbac[u6-grna-glmn,3xp3-egfp]载体上的pu6-glmn-grna scaffold-t6获得sgrna表达载体。

4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于：所述真菌为酿酒酵母。

5.提高家蚕蚕茧对真菌抑菌能力的方法，其特征在于：通过在家蚕中敲除spi51基因基因，筛选纯合突变个体，获得抑制真菌能力好的家蚕品种。

6.根据权利要求5所述提高家蚕蚕茧对真菌抑菌能力的方法，其特征在于：所述敲除spi51基因表达的方法是通过zfns、talens和crispr/cas9或其变体介导靶标spi51基因敲除。

7.根据权利要求5所述提高家蚕蚕茧对真菌抑菌能力的方法，其特征在于：所述敲除spi51基因表达的方法是通过crispr/cas9介导敲除家蚕spi51基因。

8.根据权利要求6所述提高家蚕蚕茧对真菌抑菌能力的方法，其特征在于：所述crispr/cas9介导敲除家蚕spi51基因由cas9表达载体与靶标spi51基因的sgrna的双元转基因系统介导。

9.根据权利要求7所述提高家蚕蚕茧对真菌抑菌能力的方法，其特征在于：所述靶标spi51基因的sgrna由seq id no.2和seq id no.3所示核苷酸序列退火形成双链。

10.根据权利要求4所述提高家蚕蚕茧对真菌抑菌能力的方法，其特征在于：制备cas9转基因家蚕；然后构建靶标spi51基因的sgrna表达载体，并制备sgrna转基因家蚕；将sgrna转基因家蚕和cas9转基因家蚕进行杂交、荧光筛选不可再继续产生编辑的个体进行pcr分型检测，筛选到杂合体，杂合体自交，经过对突变序列的分型检测及克隆测序鉴定出后代中的纯合突变个体，获得家蚕纯裸蛹品种。

技术总结
本发明公开了家蚕中敲除SPI51基因表达在制备提高蚕茧对真菌抑菌能力中的应用，本发明通过使用基因工程技术将家蚕中SPI51基因敲除，获得SPI51基因功能缺陷的家蚕品系，获得的家蚕结茧后能够提高蚕丝的真菌的抑菌能力，能够有效解决目前真菌类耐药性的问题。

技术研发人员：赵萍,张晓璐,郭凯雨,夏庆友
受保护的技术使用者：西部（重庆）科学城种质创制大科学中心
技术研发日：
技术公布日：2024/5/16