一种人视网膜色素上皮细胞的纯化、培养方法与流程

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种人视网膜色素上皮细胞的纯化、培养方法。

背景技术：

1、视网膜退行性疾病是可导致患者视力不可逆性损伤的一类疾病，该疾病以视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，rpe）细胞及光感细胞进行性破坏及缺失为主要特点，主要包括年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，amd）、视网膜色素变性（retinitis pigmentosa，rp）及stargardt黄斑营养不良（smd），其中amd是老年人中主要的致盲疾病，而smd好发于青少年。视网膜退行性疾病的发病机制决定了细胞替代疗法可能是一种可以从病因上控制和治疗该类疾病的方法。

2、视网膜色素上皮细胞移植是治疗年龄相关性黄斑变性及视网膜色素变性非常有前景的方案，目前在实验室模型动物以及临床前期实验中取得较好的效果。目前用于移植的视网膜色素上皮来源主要依赖于胚眼、人胚胎干细胞及诱导多能干细胞分化来源。胚眼来源的细胞数量有限，而且由于伦理限制，限制了产业化的应用。

3、多能干细胞体外分化来源的这些组织或者分化的细胞群体中视网膜色素上皮的产量较低，需要进行分离纯化。目前分离、纯化视网膜色素上皮的方案主要通过物理观察，从多能干细胞二维或者三维诱导分化的细胞群体中挑取带有黑色素的细胞团体。然而这种分离方式过度依赖于人工挑取，而且批次间差异较大；较为严重的问题是细胞纯度低，还不能充分去除未分化的细胞，存在潜在的成瘤风险，这些都是限制其产业化应用的重要瓶颈问题。

技术实现思路

1、为解决视网膜色素上皮细胞（rpe）难以被产业化应用的技术问题，本发明通过对8万个多能干细胞体外3d诱导分化来源的类视网膜组织的细胞悬液进行单细胞转录组测序，并通过生物信息学挖掘，鉴定出人视网膜色素上皮细胞特异的表面标记物itgav，并针对该分子使用单克隆抗体，偶联磁珠后，多能干细胞三维诱导分化的类视网膜组织及多能干细胞二维自分化细胞群体进行磁力筛选（macs），有效去除混杂细胞，获取高纯度的视网膜色素上皮细胞。并且，针对不同发育阶段的人视网膜色素上皮细胞给与系列培养基支持，进行视网膜变性模型rcs大鼠视网膜下腔移植后，可显著改善动物的电生理功能。使用我们的细胞分化及培养体系，可获取高纯度、高质量的种子细胞，并可在液氮内保存，可根据需要随时复苏，促进人视网膜色素上皮的产业化应用。

2、具体技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了itgav的特异性结合试剂在纯化和/或制备视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，rpe）细胞中的应用。

4、优选地，所述视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，rpe）细胞是人的视网膜色素上皮细胞。

5、另一方面，本发明提供了itgav的特异性结合试剂在制备视网膜色素上皮细胞移植产品中的应用。

6、优选地，所述特异性结合试剂包括抗体、适配体、探针等。

7、最优选地，所述特异性结合试剂是抗体。

8、优选地，所述抗体包括fab片段、fab’片段、f（ab’）片段、双抗体或scfv。

9、本发明所述术语“抗体”包括涉及任何同型或子类的糖基化和非糖基化免疫球蛋白或涉及其与完整抗体竞争特异性结合的抗原结合区，包括人类、人源化、嵌合、多特异性、单克隆、多克隆抗体和其寡聚物或抗原结合片段。还包括具有抗原结合片段或区域的蛋白，例如fab、fab’、f（ab’）2、fv、双体抗体、fd、dab、大型抗体、单链抗体分子、互补决定区（cdr）片段、scfv、二体抗体、三体抗体、四体抗体和多肽，其含有至少一部分足以赋予与标靶多肽的特异性抗原结合的免疫球蛋白。所述抗体的生产方法包括但不限于通过重组手段制备、表达、产生或分离的抗体，诸如从被转染以表达抗体的宿主细胞分离的抗体。

10、本发明所述itgav也可称integrin subunit alpha v或整联蛋白αv，其ensemblid为ensg00000138448。

11、另一方面，本发明提供了一种制备视网膜色素上皮细胞的方法，所述方法包括通过itgav的特异性结合试剂分选视网膜色素上皮细胞。

12、优选地，所述分选所针对的细胞是胚胎干细胞（embryonic stem cells，esc）或者诱导多能干细胞（induced pluorescent stem cells，ipscs）诱导分化所得到的类视网膜组织的色素团细胞。

13、更优选地，所述方法还包括诱导胚胎干细胞分化出类视网膜组织的色素团细胞的步骤。

14、更具体地，所述方法是将itgav的特异性结合试剂与磁珠偶联，通过磁力柱筛选出itgav表达的细胞。

15、另一方面，本发明提供了前述方法所制备得到的细胞或高表达itgav的rpe细胞在制备治疗眼科疾病的药物、rpe移植产品中的应用。

16、另一方面，本发明提供了一种治疗眼科疾病的方法，所述方法包括向患者施用上述方法所制备得到的细胞。

17、具体地，所述施用方式包括视网膜下腔注射。

18、优选地，所述眼科疾病包括视网膜退行性疾病，或，rpe细胞异常而导致的眼科疾病。

19、更具体地，所述眼科疾病包括年龄相关性黄斑变性（age-related maculardegeneration，amd）、视网膜色素变性（retinitis pigmentosa，rp）、stargardt黄斑营养不良（stargardt macular degeneration，smd）等。

20、更具体地，所述amd疾病可分为非渗出性amd，也称干性amd（dry-amd），和渗出性amd，也称湿性amd（wet-amd）。

21、另一方面，本发明提供了包含前述方法制备得到的细胞的组合物。

22、优选地，所述组合物中还可以包括药学上可接受的载体，所述可作为药学上可接受的载体的具体例子包括糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。本发明的组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。

23、本发明所述“治疗”包括通过所述方法制备到的细胞来阻止或延缓疾病(如肿瘤)的症状和并发症的出现。治疗也可以是预防性。对肿瘤的治疗也指在个体控制肿瘤的进展，延长肿瘤患者的生存期，改善生活质量，减轻症状，使肿瘤缩小甚至消除，使肿瘤转移受到遏制。将所述方法制备到的细胞进行视网膜下腔注射后可以有效的提升视网膜功能。

24、本发明所述治疗所针对的”受试者”包括任何动物（例如，哺乳动物），包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿类动物等，落在本发明的范围内的合适的动物包括灵长目动物、啮齿动物（例如，小鼠、大鼠、豚鼠）、兔形目动物（例如，家兔、野兔）、牛科动物（例如，牛）、绵羊类动物（例如，绵羊）、山羊类动物（例如，山羊）、猪类动物（例如，猪）、马科动物（例如，马）、犬科动物（例如，狗）、猫科动物（例如，猫）、鸟类动物（例如，鸡；鸭；鹅；陪伴鸟类，诸如金丝雀、虎皮鹦鹉等）、海洋哺乳动物（例如，海豚、鲸鱼）、爬行动物（例如，蛇、青蛙、蜥蜴等）和鱼。其将成为特定治疗的接受者。通常，术语“受试者”和“患者”在涉及人受试者时在本文中可互换地使用。

25、优选地，所述受试者是人。

26、另一方面，本发明提供过了检测itgav表达量的试剂在判断目标细胞群体中视网膜色素上皮（rpe）细胞含量中的应用。

27、优选地，所述目标细胞群体是眼细胞，更优选地，是本发明具体实施例所诱导分化出的类视网膜组织的色素团细胞。

28、优选地，所述表达量包括蛋白表达量和mrna表达量。

29、优选地，所述mrna表达量的检测试剂是本领域公知的，包括但不限于特异性结合目标序列的核酸探针、扩增目标序列的引物、非特异性荧光染料（例如，sybr green i）或其组合。

30、优选地，所述蛋白表达量的检测试剂包括免疫学检测所需的试剂；所述免疫学检测包括elisa检测、elispot检测、western印迹或表面等离子共振法。免疫学检测所需要的试剂是本领域熟知的，包括但不限于能够与itgav特异性结合的抗体、靶向多肽。

31、具体地，所述itgav表达量高则代表rpe细胞的含量高。