基于生物酶催化转化功能减少体内高热量糖吸收的方法及应用与流程

本发明属于酶，具体涉及基于生物酶的催化转化减少人体对葡萄糖等高热量糖吸收的方法。

背景技术：

1、糖类又称为“碳水化合物”，是我们人体能量的主要来源。在人体内代谢过程中，糖类经过“燃烧”释放能量，供人体运动及生长需要，人的脑组织仅依靠葡萄糖供能。糖类参与人体多种重要的生命活动，它与体内的其他物质结合构成酶、抗体、激素等，对调节人体的生理功能具有十分重要的意义。大多数的单糖和双糖其以良好的甜味口感和实惠的价格被广泛用于饮食产品。在营养学方面，膳食中常见的糖类添加剂主要有葡萄糖，果糖和蔗糖等单糖和双糖；此外，米饭和馒头等主食中含有大量的淀粉，淀粉属于多糖的一种。

2、然而，不断有报道称，体内高浓度糖的升高会给人体带来严重的危害。人们所摄入食物中的淀粉和砂糖最终被分解成单糖(葡萄糖、果糖等)，并在小肠中被吸收。一旦我们从食物中直接摄入的葡萄糖等单糖，以及淀粉等能在体内被分解为葡萄糖等的高热量物质过量，将会引发一系列成人病，危害健康。诸如：导致肥胖：葡萄糖是高热量的碳水化合物，过量的葡萄糖会转化为脂肪，导致体重增加和肥胖；影响血糖水平：葡萄糖的摄入可以导致血糖水平升高，过量的葡萄糖摄入导致胰岛素分泌过多，从而增加患糖尿病的风险；不利于心血管健康：过量的葡萄糖摄入会导致高血压、高胆固醇和动脉硬化等疾病，这些疾病都会增加心血管疾病的风险；损害牙齿健康：葡萄糖可以为口腔中的细菌提供生长所需的能量，从而导致龋齿和口臭等问题。

3、所以，为了预防成人病，保持适当的血糖值非常重要。

4、国际稀有糖协会(internationalsocietyofraresugars，isrs)定义稀有糖为自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物，其味类似于蔗糖，但具有热量低、稳定性高、甜昧协调、无吸湿性、无致龋齿性、耐受性高等优点，可以弥补传统甜味剂的不足，对改善特殊人群的饮食和健康具有重要作用。稀少糖中较典型的代表是d-阿洛酮糖和d-塔格糖，除具有低热量特点，还在抑制血糖升高与体脂积累、清除自由基、神经保护、修饰药物或活性物质从而优化其功能活性等诸多方面发挥着重要生理活性作用，是糖尿病及肥胖症人群的新型甜味剂。

5、部分稀少糖可以抑制脂肪肝酶和肠道α-糖苷酶，从而降低小肠对糖的吸收，抑制体内脂肪的积累和血糖浓度的上升，提高胰岛素的敏感性。因此，稀少糖具有潜在的降血糖作用，可以降低餐后高血糖，提高胰岛素的敏感性和葡萄糖耐受性，在研制治疗肥胖和糖尿病药物方面具有重要的应用价值。

6、然而，关于稀少糖的生产和应用大都是工业化和商品化方向。本发明基于人体内(包括但不限于人体肠道内)糖的转化，利用多种生物酶催化方法，将高热量糖包含饮食中直接摄入的葡萄糖，果糖(包括但不限于)等单糖，或者食物中的淀粉、砂糖、乳糖(包括但不限于)等碳水化合物经口腔和消化道水解后得到的葡萄糖等转化为低热量的稀少糖，通过这种手段实现在人体内由高热量糖到低热量稀少糖的转化。

7、肠道是人体重要的消化器官，人体大量的消化作用和几乎全部消化产物的吸收都是在小肠内进行的。因此，保护生物活性因子安全过胃，通过胃部缓释，最终定位于小肠中发挥其作用，对蛋白质和肽类生物活性剂的研发具有重要意义。本发明主要是基于人体内葡萄糖等高热量糖的转化，在模拟人体胃肠消化环境中，以葡萄糖，果糖，乳糖和淀粉(包括但不限于)为例，以药物递送系统包裹的生物酶的催化下，实现到稀少糖的转化。所述葡萄糖在葡萄糖异构酶的作用下转化为果糖，依次果糖在d-阿洛酮糖3-差向异构酶的作用下转化为d-阿洛酮糖；淀粉在糖化酶的催化下水解为葡萄糖，葡萄糖经过多酶催化最终转化为d-阿洛酮糖；乳糖在乳糖酶的作用下转化为半乳糖和葡萄糖，再通过多酶催化最终转化为d-塔格糖和d-阿洛酮糖。本发明的有益效益是，基于人体内糖的转化，将高热量糖转化为低热量、不被人体直接吸收的稀少糖，减少小肠对高热量糖(包括但不限于葡萄糖和果糖)，目的是用于预防、治疗和/或缓解因血糖值高而引起的一系列成人病，如糖尿病和肥胖症。

技术实现思路

1、本发明提供一种基于生物酶的催化转化功能，来降低体内葡萄糖等高热量糖吸收的方法；具体地，本发明提供一种在人体肠道环境中，由高热量糖转化为稀少糖的方法；更具体地，在模拟人体肠道环境中，由药物递送系统包裹的生物酶的作用下，本发明提供由葡萄糖、果糖转化为d-阿洛酮糖、乳糖转化为d-塔格糖的方法。此外，本发明提供葡萄糖异构酶和d-阿洛酮糖3-差向异构酶，还涉及表达上述两种酶的基因工程菌株和构建方法，以及利用该工程菌株发酵葡萄糖异构酶和d-阿洛酮糖3-差向异构酶制剂的应用。

2、本发明采用以下技术方案：

3、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于，基于人体的消化功能和肠道环境，提供一种肠道药物递送系统；并以葡萄糖，果糖，乳糖和淀粉为例(包括但不限于)，提供一种经药物递送系统包裹的酶法转化高热量糖得到稀少糖的方法，所述人体内高热糖的来源可以是直接从食物中摄取的葡萄糖等单糖，也可以是能够在消化过程中转化为葡萄糖和果糖等的大分子碳水化合物(如淀粉)。在本发明的实施例中，用糖化酶对淀粉进行处理实现淀粉到葡萄糖的转化，代替淀粉在消化系统中的分解过程。本发明提供的酶组合物能够降低人体内高热量的糖含量，减少人体对高热量糖的吸收，从而达到控制血糖和体重目的。

4、本发明首先提供一种糖异构酶双酶组合物，由葡萄糖异构酶和d-阿洛酮糖3-差向异构酶组成；所述的葡萄糖异构酶源自thermobifidafusca yx，arthrobacter sp.，escherichia coli k12，limosilactobacillusreuteri，mycobacterium sp.root135，streptomyces olivaceoviridis或thermus thermophilus strain hb8；所述d-阿洛酮糖3-差向异构酶源自enteroclosterbolteae，agrobacterium tumefaciens，pseudomonascichorii，rhodobactersphaeroides，clostridium cellulolyticum，clostridiumscindens或ruminococcus sp.5_1_39bfaa；

5、更优选地，所述葡萄糖异构酶源自thermobifidafuscayx，其氨基酸序列如seq idno.1所示；或源自arthrobacter sp.，其氨基酸序列如seq id no.2所示；或源自thermusthermophilus strain hb8，其氨基酸序列如seq id no.3所示；

6、所述d-阿洛酮糖3-差向异构酶源自enteroclosterbolteae，其氨基酸序列如seqid no.4所示；或源自pseudomonas cichorii，其氨基酸序列如seq id no.5所示；或源自clostridium cellulolyticum，其氨基酸序列如seq id no.6所示；或源自clostridiumscindens，其氨基酸序列如seq id no.7所示；或源自ruminococcus sp.5_1_39bfaa，其氨基酸序列如seq id no.8所示。

7、本发明还提供所述的糖异构酶双酶组合物在催化葡萄糖转化为d-阿洛酮糖中的应用。

8、本发明进一步提供一种包埋所述的糖异构酶双酶组合物的适用人体肠道的递送系统，其是将所述的糖异构酶双酶组合物用再生纤维素水凝胶进行包裹得到，其中所述再生纤维素水凝胶的制备方法如下：

9、将介孔二氧化硅和负载糖异构酶双酶组合物的再生纤维素水凝胶载体进行聚合，得到纤维素/活性剂/介孔二氧化硅的包埋组合物递送系统产品；

10、任选地，还对所得的纤维素/活性剂/介孔二氧化硅的包埋组合物递送系统粗产品进行过滤并反复洗涤，除去残留的溶剂，并进行冻干处理，得到口服肠道定位递送系统；

11、所述负载糖异构酶双酶组合物的再生纤维素水凝胶载体是将活性剂与再生纤维素水凝胶载体混合搅拌直至活性剂完全负载于纤维素水凝胶中而得到；而所述再生纤维素水凝胶通过纤维素溶解于碱/尿素形成纤维素溶液，以乙醇为沉淀剂再生制备得到；

12、所述介孔二氧化硅是teos经过溶胶-凝胶法制备的；

13、所述活性成分是融合纤维素结合肽的生物药，包括但不限于肽、酶、蛋白质、核酸、抗体偶联物或其衍生物等，优选地，融合纤维素结合肽的生物药是将纤维素结合肽与相关生物药融合表达得到，另外优选地，所述再生纤维素水凝胶和活性剂的质量比为0.5-10:1，优选为1-5：1，更优选为2：1的比例混合。

14、进一步地，所述再生纤维素水凝胶为多孔纤维素纤维，平均孔径为1～5μm；

15、所述纤维素溶液是纤维素溶解在碱和尿素的水溶液中，纤维素溶液中纤维素的总浓度为1-8％，优选3-5％；

16、所述碱为碱金属的氢氧化物，优选为naoh，所述碱/尿素水溶液的浓度为6-10％(w/v)naoh，2-20％(w/v)尿素，优选为6-8％(w/v)naoh，10-15％(w/v)尿素；

17、所述纤维素为天然纤维素或微晶纤维素。

18、具体实施方式中，所述再生纤维素水凝胶的制备步骤如下：将纤维素溶解在碱和尿素的纤维素溶液滴加到浓度为10-50％的乙醇水溶液中进行再生，得到再生纤维素水凝胶粗产品；过滤除去残留的乙醇溶剂，得到再生纤维素水凝胶。

19、更具体地，所述再生纤维素水凝胶的制备方法，s1纤维素溶解：取纤维素粉末，加入到碱/尿素的离子溶液中，冰浴搅拌溶解得到透明均匀的纤维素溶液；

20、s2纤维素溶液沉淀再生形成纤维素水凝胶：向凝固剂中滴加纤维素溶液，并搅拌，以形成白色半透明状的纤维素水凝胶；所述凝固剂是由水和乙醇充分混合制成；

21、更优选地，s1中，将纤维素粉末加入到离子溶液中，在4℃冰浴条件下，600-1000rpm搅拌30～60min使纤维素充分溶解，直至得到透明均匀的纤维素溶液。

22、另外优选地，s2中，在室温条件下，向乙醇水溶液中缓慢滴加纤维素溶液，期间不断搅拌，搅拌得到分散均匀、白色半透明状的再生纤维素水凝胶固体悬液体系。

23、任选地，进一步包括下述步骤：

24、s3将纤维素水凝胶转移到固液分离模具中，通过过滤截留固态纤维素凝胶，然后用生物缓冲液或纯水多次洗涤，直至纤维素凝胶呈中性即得；任选地，还将凝胶取出重悬至生物缓冲液或纯水中使用或放置4℃冰箱冷藏待用。

25、在具体实施方式中，所述介孔二氧化硅的制备步聚如下：于纯水中加入teos和hcl，于室温下搅拌溶解，直至混合溶液呈现均匀状态，得到sio2水溶液；

26、优选地，所述水：teos：hcl的体积比为10000-3000:500-2000:40-60，搅拌转速为800～1200rpm，时间为2～4h。

27、优选实施方式中，所述聚合是将负载糖异构酶双酶组合物的再生纤维素水凝胶载体与所述介孔二氧化硅水溶液混合得到共混体系，经过不断搅拌，形成纤维素/活性剂/介孔二氧化硅的包埋组合物递送系统；

28、负载糖异构酶双酶组合物的再生纤维素水凝胶载体与所述介孔二氧化硅水溶液体积比为2000-5000:50-100，优选为5000:80；

29、所述共混体系的搅拌转速为180-220rpm，时间为12-20h，聚合反应的温度为4℃。

30、在具体实施方式中，对所得的纤维素/活性剂/介孔二氧化硅的包埋组合物递送系统粗产品进行过滤并反复洗涤，所述洗涤液是tris-hcl/nacl缓冲液，优选地，tris-hcl浓度为20mm，nacl浓度为150mm，用6m hcl调ph至7.5。

31、本发明还提供基于生物酶催化转化功能减少体内高热量糖吸收的方法，其是通过口服所述的递送系统来实现，更具体地，其与饮食物质时前半小时至饮食后半小时口服。更具体地，所述递送系统包裹后的生物酶经肠溶性胶囊封装后用于人体口服，能够更好的保护生物酶活性物质过胃缓释，在肠道中发挥活性，减少人体对葡萄糖等高热量糖的吸收，以此达到控制体内热量及减少脂肪生成的目的。所述生物酶递送系统可以用于预防、治疗和/或缓解因血糖值高而引起的一系列成人病，如糖尿病和肥胖症等。

32、从本发明提供的肠道药物递送系统出发，本发明的有益效果是基于人体内高热量糖的分解或转化，其高糖包括但不限于淀粉和乳糖等能分解为葡萄糖等的多糖或寡糖，或直接摄入的葡萄糖、果糖等高糖。其方法是利用多种生物酶催化将高热量糖转化为低热量、不被人体直接吸收的稀少糖，减少小肠对高热量糖(包括但不限于葡萄糖和果糖)。所述稀少糖包括但不限于d-阿洛酮糖和d-塔格糖等，具有低卡路里，低血糖等特点，调节血糖等有益人体健康的特殊功能，用于血糖值高的成人病、保持适当的血糖值具有重要作用。本发明的目的是通过药物送系统的包裹，有效降低肠道环境对关键酶的破坏、同时利用关键酶的催化作用减少人体对高热糖的吸收，将高热量糖转化为低热量稀少糖；利于预防、治疗和/或缓解因血糖值高而引起的一系列成人病，如糖尿病和肥胖症。