本发明涉及免疫学领域，具体而言，本发明涉及同时靶向整合素α4β7和tnf-α的双特异性抗体，编码它们的核酸分子、载体及宿主细胞，所述双特异性抗体的衍生物，以及它们用于疾病治疗的用途。
背景技术：
：：0、技术背景1、炎症性肠病(inflammatory bowel disease,ibd)是一种累及回肠、直肠、结肠的特发性慢性肠道炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,uc)和克罗恩病(crohn’s disease,cd)。ibd是由易感基因、不利环境和免疫系统功能紊乱等多因素共同导致的过度活跃的炎症反应，黏膜屏障受损和管腔菌群紊乱最终导致肠道免疫系统的连续失调。目前针对ibd的治疗措施旨在调节炎症反应，以减轻肠道炎症，促进黏膜愈合。早期非生物疗法如氨基水杨酸盐、硫嘌呤和类固醇等小分子药物可缓解炎症性肠病的症状，但不会改变整个病程的发展，且副作用明确。近年来炎症性肠病的治疗目标已经从症状控制转向逆转病程发展，越来越多的ibd患者寻求生物制剂的有效治疗，其中尤以anti-tnf-α和anti-α4β7单抗生物制剂应用最为广泛。2、英夫利昔单抗(infliximab)是首个用于治疗ibd的单克隆抗体，是一种嵌合型免疫球蛋白，通过抑制tnf-α的功能活性发挥作用，治疗后的结肠活检组织学评估显示tnf-α显著降低。此外，英夫利昔单抗能够有效降低约三分之二中重度cd患者的急性发作频率，在维持缓解和预防cd相关肠瘘复发方面具有有效性。其他靶向抑制tnf-α的单克隆抗体包括阿达木单抗(adalimumab)、赛妥珠单抗(certolizumab)和戈利木单抗(golimumab)等。维多珠单抗(vedolizumab)是属第二类已被证明对ibd有效的生物制剂，具有肠道特异性，通过特异性抑制白细胞归巢并调节肠黏膜固有免疫从而抑制炎症反应并实现肠黏膜的修复。对使用抗tnf-α药物或免疫抑制剂反应不充分、无反应或不耐受的中重度活动性ibd患者有着很好的治疗效果。3、由于现有传统抗体生物制剂存在组织穿透性差、免疫原性强等问题，造成患部药物浓度低于治疗浓度并导致二次应答缺失，从而影响持续疗效。目前单用这些制剂均存在无响应、获得性耐药几乎无法避免等问题。最新临床实验证明联合使用抗tnf-α(ada/ifx)和抗整合素α4β7(vdz)生物制剂能够使患者得到更好的临床缓解和粘膜修复，目前尚未有一块同时靶向tnf-α和整合素α4β7的生物制剂，而序贯治疗的不良反应、生物安全及药代动力学是难以评估的。4、早期的双特异性抗体(bispecific antibody,bsab)制备是将两种单克隆抗体进行融合，方法主要有化学偶联法、双杂交瘤细胞法。随着抗体工程技术尤其是噬菌体展示技术的发展，双特异性抗体的开发迎来了新的契机。近期，第四个bsab药物amivantamab也获fda准上市，用于非小细胞肺癌的治疗。由于癌症和其他疾病均是由多因素导致的，在病原学上有许多信号通路，单一靶点的免疫治疗不能有效杀死靶向细胞。接受mab治疗的患者可能会产生抗药性或对治疗无应答。因此，bsab已成为癌症、炎症、病毒感染及自身免疫病等许多疾病治疗的主要选择。随着双特异性抗体双靶点治疗技术的发展和完善，不同疾病的诊断和治疗在发展中不断得到改善，双特异性纳米抗体(bispecific nanobody,bsnb)的应用丰富了治疗方法并延续了纳米抗体分子量小、组织穿透、特异性强和对表位的深层靶向等优势，对这三个领域疾病的诊断和治疗研究者们有了更多的发现和突破。5、纳米抗体具有高水溶性、高稳定性、组织穿透力强、高抗原结合活性和低免疫原性等优点。因其免疫原性弱、结构稳定、易人源化等特点，在肿瘤、炎症等疾病的诊疗方面具有广阔的应用前景。基于现有ibd治疗生物制剂的局限性，小型化、人源化、理性设计优化的抗体药物的开发和应用是今后ibd治疗的发展方向，基于纳米抗体的tnf-α和整合素α4β7双靶向生物制剂的开发，可能为打破ibd现有治疗天花板提供新的可能。技术实现思路1、本技术的发明人基于通过噬菌体表面展示技术筛选出具备优良性能的抗整合素α4β7纳米抗体，基于此进一步提供了了同时靶向整合素α4β7和tnf-α的双特异性抗体(例如双特异性纳米抗体)，其能够有效抑制α4β7和tnf-α的生物活性，抑制炎症反应。由此提供了以下方面。2、双特异性抗体3、在一个方面，本发明提供了一种特异性结合整合素α4β7和tnf-α的双特异性抗体，其包含对整合素α4β7特异性的第一抗原结合结构域和对tnf-α特异性的第二抗原结合结构域。4、α4β7结合结构域5、本发明的双特异性抗体所包含的对整合素α4β7特异性的第一抗原结合结构域为vhh，其包含：6、(i)如seq id no:5所示的cdr1、如seq id no:6所示的cdr2以及如seq id no:7所示的cdr3；优选地，所述cdr1、cdr2和cdr3通过kabat编号系统确定；或，7、(ii)seq id no:1所示的vhh中含有的cdr1、cdr2以及cdr3；优选地，所述cdr由chothia、kabat或imgt编号系统定义。8、在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域进一步包含源自驼源重链抗体的框架区。9、在另一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域进一步包含源自人免疫球蛋白的重链框架区(例如，人重链胚系抗体基因所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区)，所述重链框架区任选地包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)从人源残基至驼源残基的回复突变。10、在某些实施方案中，所述第一抗原结合结构域包含如seq id no:1或其变体所示的vhh序列；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；在某些实施方案中，所述置换是保守置换。11、在某些实施方案中，所述第一抗原结合结构域包含如seq id no:1所示的vhh序列。12、tnf-α结合结构域13、本发明的双特异性抗体所包含的对tnf-α特异性的第二抗原结合结构域可以为任何抗体形式。14、在某些实施方案中，所述第二抗原结合结构域选自纳米抗体、全长抗体(例如igg抗体)或其抗原结合片段(例如scfv、fab、scfab)。15、在某些实施方案中，所述第二抗原结合结构域为vhh。16、在某些实施方案中，所述vhh包含：17、(i)如seq id no:8所示的cdr1、如seq id no:9所示的cdr2、如seq id no:10所示的cdr3；优选地，所述cdr1、cdr2和cdr3通过kabat编号系统确定；或18、(ii)seq id no:3所示的vhh中含有的cdr1、cdr2以及cdr3；优选地，所述cdr由chothia、kabat或imgt编号系统定义。19、在一些实施方案中，所述vhh进一步包含源自驼源重链抗体的框架区。20、在另一些实施方案中，所述第vhh进一步包含源自人免疫球蛋白的重链框架区(例如，人重链胚系抗体基因所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区)，所述重链框架区任选地包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)从人源残基至驼源残基的回复突变。21、在某些实施方案中，所述第二抗原结合结构域包含如seq id no:3或其变体所示的vhh序列；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；在某些实施方案中，所述置换是保守置换。22、在某些实施方案中，所述第二抗原结合结构域包含如seq id no:3所示的vhh序列。23、结构24、本领域技术人员应理解，本领域已知的双特异性抗体结构形式均可以用于本发明。作为示例，提供了以下双特异性纳米抗体，其中，所述第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域均为vhh。25、在某些实施方案中，所述第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域任选地通过接头连接。26、在某些实施方案中，所述第一抗原结合结构域任选地通过接头连接至所述第二抗原结合结构域的n端或c端。27、在某些实施方案中，所述第一抗原结合结构域任选地通过接头连接至所述第二抗原结合结构域的n端。28、在某些实施方案中，所述接头为肽接头(例如，刚性肽接头或柔性肽接头)；在某些实施方案中，所述肽接头由10至20个(例如，10-19个、10-18个、10至17个、10至16个、10至15个)氨基酸残基组成。29、在某些实施方案中，所述接头为包含一个或多个甘氨酸和/或一个或多个丝氨酸的肽接头。30、在某些实施方案中，所述肽接头为(g4s)n，n为不小于0的整数，例如为1、2、3或4。在某些实施方案中，所述肽接头为(ggggs)3。31、在某些实施方案中，所述双特异性纳米抗体进一步包含免疫球蛋白fc结构域。32、在某些实施方案中，所述免疫球蛋白fc结构域任选地通过肽接头连接至所述第一或第二抗原结合结构域的n端和/或c端(例如c端)。33、在某些实施方案中，所述双特异性抗体从n端到c端依次包含：所述第一抗原结合结构域、所述肽接头、所述第二抗原结合结构域和所述免疫球蛋白fc结构域。34、在某些实施方案中，所述免疫球蛋白fc结构域是igg的fc结构域(例如igg1、igg2、igg3或igg4的fc结构域)。35、在某些实施方案中，所述免疫球蛋白fc结构域包含如seq id no:4所示的序列。36、在某些实施方案中，所述双特异性纳米抗体包含如seq id no:11所示的序列。此处所示序列在其n端不包含起始密码子(如atg)编码的氨基酸(如甲硫氨酸(met))。本领域技术人员理解，在通过基因工程制备蛋白的过程中，由于起始密码子的作用，所产生的多肽链第一位经常为起始密码子编码的氨基酸(如met)。本发明的双特异性抗体不仅囊括在其n末端不包含起始密码子编码的氨基酸(如met)的氨基酸序列，也囊括在其n末端包含起始密码子编码的氨基酸(如met)的氨基酸序列。因此，在上述氨基酸序列的n端进一步包含起始密码子编码的氨基酸(如met)的序列也在本发明的保护范围内。37、在某些实施方案中，所述双特异性纳米抗体包含seq id no:11所示序列的变体，所述变体与seq id no:11相比差异仅在于一个或多个(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换)氨基酸残基的保守置换，或者与其所源自的抗体或其抗原结合片段具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，且基本保留了其所源自的双特异性纳米抗体的生物学功能(例如特异性结合整合素α4β7和tnf-α，中和整合素α4β7或tnf-α的生物活性)。例如，在一些实施方案中，所述变体与其所源自的双特异性纳米抗体相比，可在第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域的n端或c端处截短以使其仅包含部分fr1和/或fr4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。38、多特异性抗体39、另一方面，本发明提供了一种多特异性抗体，其包含本发明的双特异性抗体。为产生所述多特异性抗体，可以将本发明的双特异性抗体连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其他方式)至一个或多个其他结合分子(例如另外的抗体、抗体片段、肽或结合模拟物)。40、在某些实施方案中，所述多特异性抗体特异性结合整合素α4β7和tnf-α，并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标。41、在某些实施方案中，所述多特异性抗体还包含至少一种具有针对第三靶标的第三结合特异性的第三抗体。42、抗体的制备43、本发明的抗体可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过噬菌体表面展示技术、基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或pcr扩增获得编码本发明抗体的dna分子，将所得dna分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得。44、另一方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其编码本发明的双特异性抗体或多特异性抗体。在某些实施方案中，所述分离的核酸分子包含seq id no:12所示的序列或由遗传密码的简并性形成的与上述序列相关的dna序列。45、另一方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含本发明的分离的核酸分子。在某些实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等。46、另一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含如上所述的分离的核酸分子或载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。47、另一方面，提供了制备本发明的双特异性抗体或多特异性抗体的方法，其包括，在允许蛋白表达的条件下，培养如上所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述双特异性抗体或多特异性抗体。48、缀合物49、另一方面，本发明还提供了缀合物，其包含本发明的双特异性抗体或多特异性抗体以及偶联部分。50、在某些实施方案中，本发明的双特异性抗体或多特异性抗体任选地通过接头与所述偶联部分缀合。51、在某些实施方案中，所述偶联部分选自蛋白标签(protein tag)。这类蛋白标签是本领域熟知的，其实例包括但不限于his、flag、gst、mbp、ha、myc、gfp或生物素，并且本领域技术人员已知如何根据期望目的选择合适的蛋白标签(例如，纯化标签、检测标签或示踪标签)。在某些示例性实施方案中，本发明的双特异性抗体的c端连接有纯化标签。52、在某些实施方案中，所述偶联部分选自可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。本发明所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，3h、125i、35s、14c或32p)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(fitc)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(tritc)、藻红蛋白(pe)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如cy7、alexa 750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物)、磁珠(例如，)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。在某些实施方案中，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。在某些实施方案中，可通过不同长度的接头(linker)将如上所述的可检测的标记连接至本发明的双特异性抗体，以降低潜在的位阻。53、在某些实施方案中，所述偶联部分选自治疗剂，例如抗炎药物或免疫抑制剂。54、在某些实施方案中，所述偶联部分选自另外的生物活性多肽。55、药物组合物56、另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有本发明所述的双特异性抗体、多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。57、在某些实施方案中，所述药物组合物还可以包含另外的药学活性剂。58、在某些实施方案中，所述另外的药学活性剂是抗炎药物或免疫抑制剂。59、在某些实施方案中，在所述药物组合物中，本发明的双特异性抗体、多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物与所述另外的药学活性剂可以作为分离的组分或作为混合的组分提供。因此，本发明的双特异性抗体、多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。60、在某些实施方案中，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂可以包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。61、本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明所述的双特异性抗体、多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物。“预防有效量”是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量。“治疗有效量”是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。62、治疗应用63、另一方面，本发明提供了在受试者中预防和/或治疗与整合素α4β7有关和/或与tnf-α有关的疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用本发明的双特异性抗体、多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、缀合物或本发明的药物组合物。本发明还涉及所述双特异性抗体、多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、缀合物或药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于在受试者中预防和/或治疗与整合素α4β7有关和/或与tnf-α有关的疾病。64、在某些实施方案中，所述与整合素α4β7有关的疾病以整合素α4β7表达升高和/或过度的整合素α4β7活性为特征。65、在某些实施方案中，所述与tnf-α有关的疾病以tnf-α表达升高和/或过度的tnf-α活性为特征。66、在某些实施方案中，所述疾病为炎性疾病或自身免疫性疾病，例如，炎症性肠病(例如，克罗恩病、溃疡性结肠炎)、类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病(例如，斑块状银屑病)、系统性红斑狼疮、强直性脊椎炎、移植物抗宿主病、化脓性汗腺炎，银屑病关节炎、多关节型幼年特发性关节炎、白塞氏综合征、葡萄膜炎、牛皮癣。67、在某些实施方案中，所述疾病选自炎症性肠病(例如，克罗恩病、溃疡性结肠炎)。68、在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。69、在某些实施方案中，所述双特异性抗体、多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、缀合物或药物组合物单独使用，或与另外的药学活性剂(例如抗炎药物或免疫抑制剂)联合使用。70、本发明的双特异性抗体、多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、缀合物或本发明的药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。71、一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的抗体或其抗原结合片段，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，ph调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。72、本发明的双特异性抗体、多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、缀合物或本发明的药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在某些实施方案中，本发明的双特异性抗体、多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物或本发明的药物组合物通过静脉注射或推注给予。73、检测应用74、另一方面，本发明提供了检测整合素α4β7和/或tnf-α在样品中的存在或其含量的方法，其包括使用本发明的双特异性抗体或缀合物。75、在某些实施方案中，所述方法是免疫学检测，例如免疫印迹法、酶免疫测定法(例如elisa)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。76、在某些实施方案中，用于所述方法的缀合物包含本发明的双特异性抗体以及可检测的标记。77、在某些实施方案中，用于所述方法的双特异性抗体带有可检测的标记。78、在某些实施方案中，用于所述方法的双特异性抗体不带有可检测的标记。因此，所述方法还可以包括使用带有可检测的标记的其他试剂(如第二抗体)来检测本发明的双特异性抗体。79、在某些实施方案中，所述方法包括以下步骤：80、(1)将所述样品与本发明的双特异性抗体或缀合物接触；81、(2)检测所述双特异性抗体或缀合物与抗原之间复合物的形成或检测所述复合物的量。82、所述复合物的形成表明存在抗原或表达抗原的细胞；83、其中，所述抗原选自整合素α4β7或tnf-α。84、所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品)。85、在某些实施方案中，所述方法用于诊断受试者是否患有与整合素α4β7有关和/或与tnf-α有关的疾病。在此类实施方案中，所述方法还可以包括：将所述整合素α4β7和/或tnf-α在来自所述受试者的样品中的量与参考值进行比较的步骤。所述参考值可以是整合素α4β7和/或tnf-α在来自已知不具有与整合素α4β7有关和/或与tnf-α有关的疾病的受试者(例如健康对照)的样品中的水平(也称作“阴性参考值”)。例如，如果整合素α4β7和/或tnf-α在来自所述受试者的样品中的量相对于阴性参考值升高时，则指示所述受试者患有与整合素α4β7有关和/或与tnf-α有关的疾病。86、在某些实施方案中，所述与整合素α4β7有关的疾病以整合素α4β7表达升高和/或过度的整合素α4β7活性为特征。在某些实施方案中，所述与整合素α4β7有关的疾病为炎性疾病或自身免疫性疾病。在某些实施方案中，所述与整合素α4β7有关的疾病为炎症性肠病(例如，克罗恩病、溃疡性结肠炎)。87、在某些实施方案中，所述与tnf-α有关的疾病以tnf-α表达升高和/或过度的tnf-α活性为特征。在某些实施方案中，所述与tnf-α有关的疾病为炎性疾病或自身免疫性疾病。在某些实施方案中，所述与tnf-α有关的疾病为炎症性肠病(例如，克罗恩病、溃疡性结肠炎)、类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病(例如，斑块状银屑病)、系统性红斑狼疮、强直性脊椎炎、移植物抗宿主病、化脓性汗腺炎，银屑病关节炎、多关节型幼年特发性关节炎、白塞氏综合征、葡萄膜炎、牛皮癣。88、在某些实施方案中，所述样品可以选自尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞(即游离细胞)、组织(例如手术切除的肿瘤组织、活体组织切片或细针抽吸组织)、组织学制备物等。89、在某些实施方案中，所述整合素α4β7是人整合素α4β7。90、在某些实施方案中，所述tnf-α是人tnf-α。91、另一方面，提供了本发明的双特异性抗体或缀合物在制备检测试剂中的用途，所述检测试剂用于检测整合素α4β7和/或tnf-α在样品中的存在或其水平或者用于诊断受试者是否患有与整合素α4β7有关和/或与tnf-α有关的疾病。92、在某些实施方案中，用于制备检测试剂的缀合物包含本发明的双特异性抗体以及可检测的标记。93、在某些实施方案中，用于制备检测试剂的双特异性抗体带有可检测的标记。94、在某些实施方案中，用于制备检测试剂的双特异性抗体不带有可检测的标记。在此类实施方案中，所述检测试剂可以进一步包含能够检测本发明的双特异性抗体的其他试剂(如第二抗体)。95、术语定义96、在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子生物学、生物化学、核酸化学、免疫学等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。97、当本文使用术语“例如”、“如”、“诸如”、“包括”、“包含”或其变体时，这些术语将不被认为是限制性术语，而将被解释为表示“但不限于”或“不限于”。98、除非本文另外指明或根据上下文明显矛盾，否则术语“一个”和“一种”以及“该”和类似指称物在描述本发明的上下文中(尤其在以下权利要求的上下文中)应被解释成覆盖单数和复数。99、如本文中所使用的，术语“整合素α4β7”“α4β7”是指由α4亚单位(cd49d)和β7亚单位组成的整合素，主要表达于记忆性t淋巴细胞，其与配体粘膜地址素细胞粘附分子-1(mucosal addressin cell adhesion molecule-1，madcam-1)相互作用可使淋巴细胞进入胃肠道。α4β7的序列是本领域技术人员公知的，其中，α4亚基序列可参见例如ncbi gene id:3676、uniprot id:p13612-1，β7亚基序列可参见例如ncbi gene id:3695、uniprot id:p26010-1。100、如本文中所使用的，术语“tnf-α”是指肿瘤坏死因子α，由巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、cd4+t细胞、nk细胞分泌。tnf-α属于促炎细胞因子，参与正常炎症反应和免疫反应，可以协同调节其它细胞因子的产生、细胞存活和死亡来协调组织的稳态。tnf-α的序列是本领域技术人员公知的(参见，例如ncbi gene id:7124、ncbi genbank数据库登录号：nm_000594.4)。101、如本文中所使用的，术语“驼源抗体”是指，经免疫接种或抗原入侵的骆驼科(camelidae)动物(包括骆驼(camel)、羊驼(alpaca)和大羊驼(l.glama))所产生的针对该抗原的抗体。本领域技术人员已知，在骆驼科动物所产生的抗体中存在缺失轻链的“重链抗体”(camelid heavy-chain antibody,hcab)，这种抗体只包含一个重链可变区(variabledomain of heavy chain of hcab,vhh)和两个常规的ch2与ch3区，并且单独克隆并表达出来的vhh区具有很好的结构稳定性与抗原结合活性，vhh是目前己知的可结合目标抗原的最小单位。102、如本文中所使用的，术语“纳米抗体(nanobody)”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指由单个单体可变抗体结构域(例如单个重链可变区)所组成的抗体片段，通常来源于重链抗体(例如骆驼科动物抗体或鲨鱼抗体)的可变区。典型地，纳米抗体由4个构架区和3个互补性决定区组成，具有fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4的结构。纳米抗体可在n端或c端处截短以使其仅包含部分fr1和/或fr4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。纳米抗体也称为单域抗体(single-domainantibody,sdab)，两者可互换使用。103、如本文中所使用的，术语“双特异性抗体”是指对两种不同抗原(或表位)具有结合特异性的抗体。双特异性抗体包含对不同抗原(或表位)具有结合特异性的两种抗原结合结构域，从而能够结合两个不同的结合位点和/或靶分子。在一些情况下，不同抗原结合结构域通过肽接头连接。术语“双特异性纳米抗体”是指由两个纳米抗体形成的双特异性抗体。104、术语“多特异性抗体”是指对至少两种(例如两种、三种或四种)不同抗原(或表位)具有结合特异性的抗体。多特异性抗体包含对不同抗原(或表位)具有结合特异性的多个抗原结合结构域，从而能够结合至少两个不同的结合位点和/或靶分子。在一些情况下，各个抗原结合结构域通过肽接头连接。105、如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“cdr”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在纳米抗体中含有三个cdr，命名为cdr1、cdr2和cdr3。这些cdr的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照kabat编号系统(kabat et al.,sequences of proteins of immunological interest,5th ed.public health service,national institutes of health,bethesda,md.,1991)、chothia编号系统(chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901-917；chothia等人(1989)nature 342:878-883)或imgt编号系统(lefranc et al.,dev.comparat.immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的纳米抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的cdr。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见lefranc et al.,dev.comparat.immunol.27:55-77,2003)。106、如本文中所使用的，术语“构架区”或“fr”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的cdr残基以外的那些氨基酸残基。107、如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(kd)表示。在本发明中，术语“kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。108、两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(ka或kon)和“解离速率常数”(kdis或koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见malmqvist m,nature,1993,361:186-187)。kdis/kon的比率等于解离常数kd(参见davies等人,annual rev biochem,1990；59:439-473)。可用任何有效的方法测量kd、kon和kdis值。在某些实施方案中，可以使用表面等离子体共振术(spr)在biacore中来测量解离常数。除此以外还可用生物发光干涉测量法或kinexa来测量解离常数。109、如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。110、如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，cho细胞，cos细胞，nso细胞，hela细胞，bhk细胞，hek 293细胞或人细胞等的动物细胞。宿主细胞可以包括单个细胞或细胞群体。111、如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个dna分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，dna序列ctgact和caggtt共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如align程序(dnastar,inc.)方便地进行的needleman等人(1970)j.mol.biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入align程序(版本2.0)的e.meyers和w.miller(comput.applbiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用pam120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入gcg软件包(可在www.gcg.com上获得)的gap程序中的needleman和wunsch(j moibiol.48:444-453(1970))算法，使用blossum 62矩阵或pam250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。112、如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和pcr介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，brummell等人，biochem.32:1180-1187(1993)；kobayashi等人protein eng.12(10):879-884(1999)；和burks等人proc.natlacad.set usa94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。113、如本文中所使用的，术语“噬菌体表面展示”技术是在各种生物学科中广泛应用的技术。噬菌体表面展示特别可用于肽(即，多肽)文库筛选方案，例如筛选肽配体和单克隆抗体。在这种技术中，dna文库被克隆为与编码噬菌体衣壳蛋白基因的遗传融合。当融合蛋白被表达并整合到病毒衣壳时，多肽文库被“展示”在病毒的表面。这种配置在展示的肽和它的编码dna之间建立了物理连接，允许在细菌宿主中扩增文库，并在几轮靶标定向选择后进行便捷的肽序列测定。噬菌体表面展示技术的应用包括亲和选择(例如，靶受体选择)，表位作图及模拟，鉴定新受体和天然配体，发现药物，发现表位用于疫苗开发和诊断及研究dna-结合蛋白质。114、本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，immunology-asynthesis(2nd edition,e.s.golub and d.r.gren,eds.,sinauer associates,sunderland,mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用a或ala表示。115、如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如remington's pharmaceutical sciences.edited by gennaro ar,19thed.pennsylvania:mack publishing company,1995)，并且包括但不限于：ph调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，ph调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、nacl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。116、如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状(例如，与整合素α4β7和/或tnf-α有关的疾病)在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。117、如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有与整合素α4β7有关的疾病。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有与tnf-α有关的疾病。118、发明的有益效果119、本发明提供了能同时靶向tnf-α和整合素α4β7的双特异性抗体，通过同时靶向tnf-α和整合素α4β7，可以阻断独立的信号通路，同时有效抑制α4β7和tnf-α的生物活性，有助于有效地防止耐药性和免疫逃逸，对于炎性疾病或自身免疫性疾病的治疗具有重要意义。120、特别地，在已报道的治疗ibd的生物制剂中，抗tnf-α单克隆抗体缺乏肠特异性，易造成不良反应及引发获得性耐药。抗整合素α4β7单克隆抗体具有肠特异性，但其作用机制使其起效慢。联合使用抗tnf-α和抗整合素α4β7生物制剂能够使患者得到更好的临床缓解和粘膜修复，然而目前很少有抗体能够同时高效抑制这两个靶点。相比之下，本发明的双特异性抗体能够在抑制单核细胞向结肠黏膜募集的同时，阻断mtnf-α-tnfr2共刺激通路，诱导cd4+t细胞凋亡从而缓解肠黏膜炎症，最终实现黏膜愈合，有效提高抗tnf-α治疗的肠特异性。121、下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得可实施。当前第1页12当前第1页12