一种用于hiPSC源外泌体纯度检测的方法及其专用消化剂与流程

本发明属于生物，具体涉及一种用于hipsc源外泌体纯度检测的方法及其专用消化剂。

背景技术：

1、外泌体是一类具有生物学活性的，由细胞分泌的细胞外囊泡。其粒径范围为30-150 nm，具有磷脂双分子层结构。外泌体携带供体细胞的分子生物学信息，如核酸、蛋白质和脂质等，参与细胞通讯及多种生理病理过程的调节。人诱导多能干细胞（human inducedpluripotent stem cell，hipsc）是一种具有强大分化再生潜力的类胚胎干细胞，可分化为人体各个器官和组织所需要的各种细胞类型。由hipsc分泌的外泌体（以下称hipsc源外泌体）已被证明具有强大的再生和抗炎作用，对心肌细胞具有保护作用，改善细胞凋亡和肥大引起的心肌损伤（admiak marta, 等人. "induced pluripotent stem cell (ipsc)-derived extracellular vesicles are safer and more effective for cardiacrepair than ipscs." circulation research122.3 (2018): 296-309.），对急性肾损伤大鼠模型也表现显著的保护效果（collino federica,  等人. "extracellular vesiclesderived from induced pluripotent stem cells promote renoprotection in acutekidney injury model." cells9.2 (2020): 453.）。因此，对hipsc源外泌体进行提纯、鉴定、检测和利用具有非常重要的临床应用价值。

2、外泌体可利用多种方法进行鉴定和检测，如纳米粒子跟踪分析（nanoparticletracking analysis，nta）、western blot等。这些方法均是针对外泌体样本总体进行检测，无法对单颗粒进行表征，也无法对外泌体与其他颗粒杂质进行区分。虽然透射电镜可以对单颗粒进行表征，但这种方法的样品制备繁琐、检测效率低、设备昂贵，并且无法进行定量。随着技术的发展，纳米流式检测法已被广泛应用于外泌体的检测（例如纯度检测），并且该方法已被外泌体协会纳入团体标准。

3、已知外泌体囊泡的脂质膜相比于蛋白聚集物，对表面活性剂的敏感度更高，因此在用纳米流式检测法对外泌体进行检测时，通常需要不同类型的表面活性剂来破坏外泌体囊泡的膜结构（cloutier nathalie, 等人. "the exposure of autoantigens bymicroparticles underlies the formation of potent inflammatory components: themicroparticle-associated immune complexes." embo molecular medicine5.2 (2013):235-249；wu cheng yeu, 等人. "membrane vesicles nucleate mineralo-organicnanoparticles and induce carbonate apatite precipitation in human bodyfluids." the journal of biological chemistry288.42 (2013): 30571-30484；rousseau matthieu, 等人. "detection and quantification of microparticles fromdifferent cellular lineages using flow cytometry. evaluation of the impact ofsecreted phospholipase a2 on microparticle assessment." plos one10.1 (2015):e0116812；arraud n, 等人. "a simple flow cytometry method improves thedetection of phosphatidylserine-exposing extracellular vesicles." journal of  thrombosis and haemostasis: jth13.2 (2015): 237-247. ）。目前，常用纳米流式检测经表面活性剂triton x-100处理前后的外泌体，通过颗粒数（通常为30 nm~200 nm粒径范围内的颗粒）的变化，来确定外泌体的纯度（györgy bence, 等人. "detection andisolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexesresulting from shared biophysical parameters." blood117.4 (2011): e39-e48.）。虽然这种方法可适用于多种来源（例如293t细胞、间充质干细胞、牛乳等）的外泌体的纯度检测，但是，这种基于triton x-100的外泌体纯度检测法并不是通用的，其在针对hipsc源外泌体时，无法检测hipsc源外泌体纯度。其他表面活性剂，例如sds（十二烷基硫酸钠）、tween20或脱氧胆酸盐虽然也可用于坏外泌体囊泡的膜结构（osteikoetxea xabier, 等人. "differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations." organic&biomolecular chemistry13.38 (2015): 9775-9782.），但这些表面活性剂在单独使用时也均不能充分破坏hipsc源外泌体囊泡的膜结构，因此不能单独用于对hipsc源外泌体的纯度进行检测。因此，本领域亟需一种可对hipsc源外泌体纯度进行检测的有效方法。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一种用于hipsc源外泌体纯度检测的方法，其使用由triton x-100和sds组合的消化剂对hipsc源外泌体样品进行消化处理，并利用纳米流式对消化处理后的样品进行检测，其中所述tritonx-100的使用终浓度为0.1%~1%，所述sds的使用终浓度为0.1%~0.5%。

2、在一些实施方式中，所述方法包括以下操作：

3、1）使用所述消化剂对hipsc源外泌体样品进行消化处理，作为表面活性剂处理组，并同步使用与所述消化剂同体积的dpbs对hipsc源外泌体样品进行消化处理，作为dpbs处理组；

4、2）利用纳米流式检测所述表面活性剂处理组和dpbs处理组的颗粒数（例如在30-200 nm范围内的颗粒数），并按照下式（i）计算hipsc源外泌体的纯度：

5、 （i）

6、式（i）中：

7、所述表面活性剂是指：triton x-100和sds；

8、所述表面活性剂本底颗粒数是指：当所述消化剂中表面活性剂浓度超过临界胶束浓度时，表面活性剂在水溶液中自发形成胶束，胶束尺寸分布广泛，其中存在与hipsc源外泌体粒径相接近的胶束，这些胶束颗粒为本底颗粒。

9、在一些实施方式中，所述方法还包括对经所述消化剂处理后的hipsc源外泌体样品进行超声处理。

10、在一些实施方式中，所述超声处理的条件为在500w以上条件下超声处理5 min以上。

11、在一些实施方式中，所述超声处理的条件为500-600w条件下超声处理5-10 min。

12、本发明另一方面提供一种用于hipsc源外泌体纯度检测的专用消化剂，其由使用终浓度为0.1%~1%的triton x-100和使用终浓度为0.1%~0.5%的sds组合而成。

13、本发明提供的所述的专用消化剂在检测hipsc源外泌体纯度中的应用以及在破坏hipsc源外泌体囊泡的膜结构中的应用也属于本发明的内容。

14、基于以上技术方案提供的用于hipsc源外泌体纯度检测的方法为使用由终浓度为0.1%~1%的triton x-100和终浓度为0.1%~0.5%的sds组合的消化剂对hipsc源外泌体样品进行消化处理，此种方法能够针对性地充分裂解hipsc源外泌体囊泡的膜结构，进而可以准确检测hipsc源外泌体的纯度。因此，本发明还提供一种专用于检测hipsc源外泌体的纯度的消化剂，其由使用终浓度为0.1%~1%的triton x-100和使用终浓度为0.1%~0.5%的sds组合而成。