来源于初发胶质瘤的人脑胶质瘤细胞系及其建立方法和应用

本发明属于生物医药，具体涉及来源于初发胶质瘤的人脑胶质瘤细胞系及其建立方法和应用。

背景技术：

1、细胞模型是上世纪60年代在欧美国家发展起来的生物医药产业“芯片”，是生物医学基础研究和药物研发的核心要素与战略性源头资源，决定着生物医药产业的原始创新能力。肿瘤细胞系作为主要的体外模型，既是探索分子肿瘤生物学的标准，也是测试新的治疗方式的临床前模型。目前大多数癌症细胞模型已经使用了几十年，永生化的细胞系经过数千代培养，其细胞基因组成和生物学行为均发生改变。已广泛用于神经肿瘤学研究的细胞系包括ln-229、u-87mg、u-251等均来源于白种人，几乎没有具有亚洲人种遗传背景的脑胶质瘤（glioma）细胞系，且明确分子分型的细胞系更少，脑胶质瘤细胞系稀少的问题严重地制约了脑胶质瘤的临床前研究。

2、基于此，本发明的发明人经过广泛而深入的研究构建得到了一种人脑胶质瘤细胞系，所述细胞系可稳定多次传代，具有成瘤性，基于所述细胞系可以制备出相应的肿瘤动物模型，其可用于人脑胶质瘤诊断试剂的研发、人脑胶质瘤药物的筛选、以及人脑胶质瘤的体外研究。另外，本发明的人脑胶质瘤细胞系的建立方法简单易操作，由于组织标本珍贵又少，使用本发明的培养方法进行原代培养更易成功，肿瘤细胞建系更易成功。相比于复制和维持的成本较高的人源肿瘤组织异种移植模型，本发明直接采用人脑胶质瘤组织进行原代培养操作简单、成本低、效率高。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于：目前本领域几乎没有具有亚洲人种遗传背景的脑胶质瘤细胞系，且明确分子分型的细胞系更少的问题。本发明提供了一种人脑胶质瘤细胞系glioma-zzg02，所述细胞系生长良好，形态均一，可稳定传代至50代以上，能够表达胶质瘤细胞的典型标记物，且较商品化的脑胶质瘤细胞系更为耐药、细胞活力显著更优，为药物测试等平台或肿瘤动物模型的构建提供了理想的细胞系模型。

2、基于此，本发明的发明人提出了本发明。本发明至少包括如下目的：

3、本发明的第一目的是提供一种人脑胶质瘤细胞系及其子代细胞系。

4、本发明的第二目的是提供上述人脑胶质瘤细胞系及其子代细胞系的相关应用，所述应用包括：在开发抑制人脑胶质瘤药物方面的应用、在制备人脑胶质瘤诊断试剂方面的应用、在人脑胶质瘤体外研究方面的应用、在构建人脑胶质瘤动物模型方面的应用、在构建人脑胶质瘤耐药细胞模型方面的应用、在筛选人脑胶质瘤相关生物标志物或鉴定分子靶点方面的应用等。

5、为了实现上述目的，本发明具体采用了如下技术方案：

6、第一方面，本发明提供了一种人脑胶质瘤细胞系。

7、进一步，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.45633，保藏日期为2023年07月25日。

8、在本发明中，所述人脑胶质瘤细胞系来源于胶质母细胞瘤患者，所述胶质母细胞瘤患者的具体信息如下：女，37岁，诊断为胶质母细胞瘤（nos，cns who 4级），为初发胶质瘤。在本发明的具体实施方案中，所述人脑胶质瘤细胞系是通过将上述患者来源的人脑胶质瘤细胞经过原代培养和传代培养制备获得，进一步通过一系列的实验验证发现本发明制备获得的所述人脑胶质瘤细胞系形态均一、生长状态良好、可稳定传代至50代以上，对于研究脑胶质瘤的侵袭和转移以及药物试验等均具有重要意义。

9、此外，本发明提供的人脑胶质瘤细胞系具有成瘤性，可以制备出肿瘤动物模型，其可用于人脑胶质瘤诊断试剂的研发、人脑胶质瘤药物的筛选、以及人脑胶质瘤的体外研究。另外，本发明提供的人脑胶质瘤细胞系的建立方法简单易操作，由于组织标本珍贵又少，使用本发明提供的培养方法进行原代培养更易成功，可直接获得原代贴壁肿瘤细胞及传代的子代细胞，肿瘤细胞建系更易成功。相比于复制和维持的成本较高的人源肿瘤组织异种移植模型，本发明直接采用人脑胶质瘤组织进行原代培养操作简单、成本低、效率高。

10、第二方面，本发明提供了一种子代细胞系。

11、进一步，所述子代细胞系由本发明第一方面所述的人脑胶质瘤细胞系传代得到。

12、在一些实施方案中，本发明所述的子代细胞系的构建方法包括如下步骤：取对数生长期的本发明第一方面所述的人脑胶质瘤细胞系在体外培养传代，细胞培养条件为：37℃、5% co2细胞培养箱；所用培养基为dmem/f12培养基。按照上述传代方法培养三代后，第四代开始更换为10%血清培养与无血清培养基各半（含5%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、1%b27、0.5% n2、insulin (10 μg/ml)、bfgf (10 ng/ml)、egf (10 ng/ml)、pdgf-ab (10 ng/ml)）进行培养。传代时，用tryple™express消化细胞。

13、在一些实施方案中，本发明提供的人脑胶质瘤细胞系或其子代细胞系可采用本领域技术人员公知的常规方法进行冻存，所述冻存方法并无特别限制，例如，将人脑胶质瘤细胞系或其子代细胞系离心后重悬于细胞冻存液中，滴度冻存盒内-80℃静置过夜，然后迅速移入液氮中进行冻存，或其他任何适用于本技术的人脑胶质瘤细胞系或其子代细胞系的冻存方法。

14、复苏冻存的方法是本领域技术人员已知或者可以容易确定的，复苏冻存细胞的方法例如可以是从液氮中取出冻存细胞，置于温水水浴中，快速振摇使细胞快速融化，用新鲜的培养液悬浮细胞后，离心，细胞用适当体积的培养基悬起，进行传代培养。

15、第三方面，本发明提供了本发明第一方面所述的人脑胶质瘤细胞系或本发明第二方面所述的子代细胞系在构建人脑胶质瘤耐药细胞模型中的应用。

16、在一些实施方案中，可将所述人脑胶质瘤细胞系或其子代细胞系接种于含特定药物的培养液中进行耐药诱导培养，进一步对耐药诱导成功的肿瘤细胞进行传代培养获得针对特定药物耐药的人脑胶质瘤细胞系。

17、在一些实施方案中，所述特定药物并无特别限制，任何本领域技术人员感兴趣的药物均在本发明的保护范围内。

18、在一些实施方案中，本发明第一方面所述的人脑胶质瘤细胞系或本发明第二方面所述的子代细胞系本身即可作为脑胶质瘤细胞模型应用于脑胶质瘤相关的研究中。

19、第四方面，本发明提供了本发明第一方面所述的人脑胶质瘤细胞系或本发明第二方面所述的子代细胞系在构建人脑胶质瘤动物模型中的应用。

20、在一些实施方案中，所述动物并无特别限制，包括但不限于：小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠等，在本发明的具体实施方案中，所述动物为免疫缺陷的小鼠，优选为balb/c免疫缺陷小鼠（雄性，鼠龄6周）。

21、在一些实施方案中，所述人脑胶质瘤动物模型根据移植接种的方式不同，分为皮下成瘤模型、原位移植模型、尾静脉注射肿瘤转移模型。

22、其中，皮下成瘤模型是将肿瘤细胞或肿瘤组织直接接种在小鼠的皮下而建立的一种肿瘤动物模型。该肿瘤模型是一种用于临床前评估药物体内药效的简单而重要的工具，同时，在肿瘤的发病机制、药物作用的研究中亦起到重要作用。该模型操作简单方便，可以直观观察肿瘤的生长，方便检测动物体重、肿瘤生长曲线、肿瘤重量等重要数据；可以对组织和体液样本进行相关分析，广泛应用于生物医学研究与药物开发中。

23、原位移植模型是将肿瘤细胞或肿瘤组织块原位移植到免疫缺陷动物的组织器官内，使之产生肿瘤并形成自发性转移灶。其方法是将稀释好的肿瘤细胞直接接种到器官的浆膜下。或者先将肿瘤细胞皮下接种，达500-800 mm3左右，瘤组织取出切成1-3 mm3的小块，将准备好的癌组织块植入器官的浆膜下，缝合浆膜，这样也可以形成异种原位肿瘤。常用原位接种包括：脑、肝、肌肉、乳腺垫原位。原位移植模型能更好地模拟肿瘤细胞在体内生长的微环境，模拟肿瘤生长甚至转移的过程。

24、尾静脉注射肿瘤转移模型是通过尾静脉注射肿瘤细胞后，肿瘤细胞在动物体内某个或某些器官形成肿瘤而建立的一种肿瘤模型。肿瘤细胞经尾静脉注射后，先通过肺部的毛细血管网进入动脉血液循环系统，可造成全身多发转移灶。但是由于肿瘤细胞较为粘稠易聚团，一般会被困在小鼠肺部微血管，主要形成肺转移，可能后期会造成远端器官的转移。主要用于建立肿瘤转移模型或血癌模型或者肿瘤肺转移。

25、在本发明的具体实施方案中，所述人脑胶质瘤动物模型优选为原位注射成瘤模型，更优选为脑立体定位注射成瘤模型。

26、第五方面，本发明提供了本发明第一方面所述的人脑胶质瘤细胞系或本发明第二方面所述的子代细胞系在筛选用于治疗和/或预防人脑胶质瘤的药物中的应用。

27、在一些实施方案中，可将所述人脑胶质瘤细胞系或其子代细胞系与待测试药物接触，观察并比较与待测试药物接触组和未与待测试药物接触组细胞系的生长形态，并进行测定，筛选能够治疗和/或预防人脑胶质瘤的药物。

28、在一些实施方案中，使人脑胶质瘤细胞系或其子代细胞系与待测试药物接触是指将上述人脑胶质瘤细胞系或其子代细胞系和待测试药物置于可接触的情况下。上述人脑胶质瘤细胞系或其子代细胞系与待测试药物的接触例如可以是向含有上述人脑胶质瘤细胞系或其子代细胞系的溶液中添加相应的待测试药物。

29、在一些实施方案中，所述待测试药物并无特别限制，可以是小分子化合物、蛋白质（例如抗体）、dna、rna、低分子干扰rna或反义寡核苷酸等。待测试药物例如可以是用于治疗脑胶质瘤以外的疾病的药剂。待测试药物例如可以为一种或两种以上药物的混合物。

30、在一些实施方案中，对与上述待测试药物接触的人脑胶质瘤细胞系或其子代细胞系进行测定包括测定细胞活力的变化、细胞增殖能力的变化、细胞死亡情况的变化、细胞大小的变化、细胞数量的变化、构成细胞的标志物蛋白的表达情况等。其中，细胞大小的变化例如可以是测定细胞的尺寸，细胞的尺寸例如可以使用本领域公知的装置（例如显微镜或facs）来测定。细胞的尺寸例如可以是细胞的周长、直径（例如长径和短径）或面积。

31、第六方面，本发明提供了本发明第一方面所述的人脑胶质瘤细胞系或本发明第二方面所述的子代细胞系在制备人脑胶质瘤诊断或检测试剂中的应用。

32、在一些实施方案中，可采用本发明第一方面所述的人脑胶质瘤细胞系或本发明第二方面所述的子代细胞系评价所述待测诊断或检测试剂是否能够用于准确有效区分胶质瘤细胞和正常细胞。

33、第七方面，本发明提供了本发明第一方面所述的人脑胶质瘤细胞系或本发明第二方面所述的子代细胞系在研究人脑胶质瘤发病机制、发展和转移机理、相关生物标志物或治疗靶点中的应用。

34、第八方面，本发明提供了一种人脑胶质瘤动物模型。

35、进一步，所述动物模型是通过将本发明第一方面所述的人脑胶质瘤细胞系或本发明第二方面所述的子代细胞系接种到非人哺乳动物体内构建得到。

36、第九方面，本发明提供了如下任一种方法：

37、(1) 本发明第八方面所述的人脑胶质瘤动物模型的构建方法，所述方法包括如下步骤：将本发明第一方面所述的人脑胶质瘤细胞系或本发明第二方面所述的子代细胞系接种到非人哺乳动物体内构建得到本发明第八方面所述人脑胶质瘤动物模型；

38、(2) 本发明第一方面所述的人脑胶质瘤细胞系的构建方法，所述方法包括如下步骤：获取临床人脑胶质瘤组织，对所述人脑胶质瘤组织进行原代培养，对所述原代培养的肿瘤细胞进行传代培养，获得本发明第一方面所述人脑胶质瘤细胞系。

39、进一步，所述非人哺乳动物为免疫缺陷的小鼠；

40、所述接种的细胞数量为2×105个；

41、所述接种的方式为原位注射；优选为脑立体定位注射；

42、所述原代培养采用的培养基的组成为：dmem/f12培养液、2% b27、1% n2、20 μg/mlinsulin、20 ng/ml bfgf、20 ng/ml egf、20 ng/ml pdgf-ab、1 vol%青霉素/链霉素；

43、所述传代培养的培养基的组成为：dmem/f12培养液、5%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、1% b27、0.5% n2、10 μg/ml insulin、10 ng/ml bfgf、10 ng/ml egf、10 ng/ml pdgf-ab。

44、本发明涉及的生物材料的保藏信息如下：

45、保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

46、保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

47、保藏日期：2023年07月25日；

48、保藏编号：cgmcc no.45633；

49、参据的生物材料（株）：glioma-zzg02；

50、分类命名：患者来源的原代胶质母细胞瘤细胞。