β-半乳糖苷酶突变体及其应用

本发明属于生物工程，具体涉及β-半乳糖苷酶突变体及其应用。

背景技术：

1、低聚半乳糖(galactooligosaccharides,gos)为乳糖的非还原端半乳糖上连接不同数量(2～8个)的半乳糖，是一种功能性低聚糖，常作为健康食品原料广泛应用于食品等行业，多年来备受关注。gos除具有益生活性外，还有预防蛀牙和调节脂质代谢等功效。gos的安全性已得到广泛认可，如美国已将其作为公认安全的食品原料，我国也批准其为营养增强剂和新食品原料。gos与人乳中的人乳寡糖在结构与功能上具有一定的相似性，可被人体内的肠道微生物特异性利用，目前已批准用于婴幼儿配方奶粉中。

2、目前工业上生产gos的主要方法是利用β-半乳糖苷酶催化乳糖或乳清以合成gos。这种方法反应条件温和，操作简单，效率高，被认为有效且适用于规模化生产。目前，工业化生产gos所用的β-半乳糖苷酶多数来源于乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)、米曲霉(aspergillus oryzae)以及环状芽孢杆菌(bacillus circulans)等，但是大多数gos产率较低，在12％-50％之间，不足以满足工业化大量和高效生产gos的需求。

技术实现思路

1、本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

2、本发明还有一个目的是提供β-半乳糖苷酶突变体及其应用。

3、为此，本发明提供的技术方案为：

4、β-半乳糖苷酶突变体，所述β-半乳糖苷酶突变体的活性在乳糖降解中提供降解的功能，为如下a)或b)的蛋白质：

5、a)如seq id no：1所示的氨基酸序列的第331位的组氨酸被取代为缬氨酸或异亮氨酸，其氨基酸序列分别如seq id no：2、3所示，或，如seq id no：1所示的氨基酸序列的第469位的谷氨酸被取代为缬氨酸，其氨基酸序列如seq id no：4所示，或，如seq id no：1所示的氨基酸序列的第517位的组氨酸被取代为异亮氨酸，其氨基酸序列如seq id no：5所示；

6、b)在a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有β-半乳糖苷酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

7、含有一种或几种所述的β-半乳糖苷酶突变体的组合物。

8、一种dna分子，所述dna分子编码所述的β-半乳糖苷酶突变体。比如，编码seq idno：2所示的h331v突变体酶的其中一种dna分子碱基序列如seq id no：6所示，seq id no：3所示的h331i突变体酶的其中一种dna分子碱基序列如seq id no：7所示，编码seq id no：4所示的e469v突变体酶的其中一种dna分子碱基序列如seq id no：8所示，编码seq id no：5所示的h517i突变体酶的其中一种dna分子碱基序列如seq id no：9所示。当然，由于密码子的简并性，只要能够编码上述氨基酸序列的dna分子均可。

9、优选的是，所述的dna分子，所述dna分子的碱基序列如seq id no：6所示。

10、一种重组载体，其含有所述的dna分子和与所述dna分子可操作地连接的用于表达的调节序列。

11、酶突变体基因工程菌，所述宿主细胞含有所述的dna分子或所述的重组载体。

12、一种低聚半乳糖的生产方法，包括如下步骤：以乳糖为底物，加入如权利要求1所述的β-半乳糖苷酶突变体作为催化剂，在ph 7.5的mops缓冲液反应，反应结束后从反应产物中收获低聚半乳糖。

13、优选的是，所述的生产方法中，所述乳糖的浓度为300-400g/l，所述β-半乳糖苷酶突变体的用量为5u/ml。

14、优选的是，所述的生产方法中，包括如下步骤：所述β-半乳糖苷酶突变体以β-半乳糖苷酶突变体酶液的形式加入，所述β-半乳糖苷酶突变体酶液的制备方法包括：将如权利要求6所述的酶突变体基因工程菌在液体培养基中培养，当菌液od600值达到0.6-0.8时，降温，向菌液中添加异丙基硫代吡喃半乳糖苷进行诱导，然后破碎菌体，纯化后得到所述β-半乳糖苷酶突变体酶液。

15、所述的β-半乳糖苷酶突变体或所述的组合物于制备包含半乳糖医药用品、食品或饲料中的应用。

16、本发明至少包括以下有益效果：

17、本发明以来源于巴伦葛兹类芽孢杆菌β-半乳糖苷酶gh2-pbbgal2a(seq id no：1所示的氨基酸序列)为模板，构建了多个单点突变体酶h331v、h331i、e469v、h517i等。经反应条件优化，h331v生产低聚半乳糖的产率最高可达76.3％。实验结果表明，突变后该酶的反应速度和低聚半乳糖产率有了明显的提高。本发明的突变体具有催化效率快、低聚半乳糖产率高的优良性质，有利于降低益生元的成本，提高了使用该酶生产低聚半乳糖的转化效率，该β-半乳糖苷酶突变体具有较大的工业化生产和应用潜力以及经济价值。

18、本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

技术特征：

1.β-半乳糖苷酶突变体，其特征在于，所述β-半乳糖苷酶突变体的活性在乳糖降解中提供降解及转糖苷的功能，为如下a)或b)的蛋白质：

2.含有一种或几种如权利要求1所述的β-半乳糖苷酶突变体的组合物。

3.一种dna分子，所述dna分子编码如权利要求1或2所述的β-半乳糖苷酶突变体。

4.如权利要求3所述的dna分子，所述dna分子的碱基序列如seq id no：6所示。

5.一种重组载体，其含有权利要求3所述的dna分子和与所述dna分子可操作地连接的用于表达的调节序列。

6.酶突变体基因工程菌，所述宿主细胞含有权利要求3所述的dna分子或权利要求5所述的重组载体。

7.一种低聚半乳糖的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：以乳糖为底物，加入如权利要求1所述的β-半乳糖苷酶突变体作为催化剂，在ph 7.5的mops缓冲液反应，反应结束后从反应产物中收获低聚半乳糖。

8.如权利要求7所述的生产方法，其特征在于，所述乳糖的浓度为300-400g/l，所述β-半乳糖苷酶突变体的用量为5u/ml。

9.如权利要求7所述的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：所述β-半乳糖苷酶突变体以β-半乳糖苷酶突变体酶液的形式加入，所述β-半乳糖苷酶突变体酶液的制备方法包括：将如权利要求6所述的酶突变体基因工程菌在液体培养基中培养，当菌液od600值达到0.6-0.8时，降温，向菌液中添加异丙基硫代吡喃半乳糖苷进行诱导，然后破碎菌体，纯化后得到所述β-半乳糖苷酶突变体酶液。

10.如权利要求1所述的β-半乳糖苷酶突变体或如权利要求2所述的组合物于制备包含半乳糖医药用品、食品或饲料中的应用。

技术总结
本发明公开了β‑半乳糖苷酶突变体及其应用，其活性在乳糖降解中提供降解及转糖苷的功能，为如下a)或b)的蛋白质：a)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第331位的组氨酸被取代为缬氨酸或异亮氨酸，或，如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第469位的谷氨酸被取代为缬氨酸，或，如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第517位的组氨酸被取代为异亮氨酸；b)在a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有β‑半乳糖苷酶活性的由(a)衍生的蛋白质。本发明的突变体具有催化效率快、低聚半乳糖产率高的优良性质，有利于降低益生元的成本，具有较大的工业化生产和应用潜力以及经济价值。

技术研发人员：辛凤姣,王钰璐,于海燕,江正强,杨绍青
受保护的技术使用者：中国农业科学院农产品加工研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/5/10