一种维持细胞高活率的重组胰酶细胞消化液的制作方法

本申请涉及细胞培养的，更具体地说，涉及一种维持细胞高活率的重组胰酶细胞消化液。

背景技术：

1、胰蛋白酶是从牛、羊、猪的胰脏提取的一种丝氨酸蛋白水解酶，在脊椎动物中作为消化酶而起作用，被广泛应用于生物领域和医疗领域。胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链n端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。

2、由于动物源胰蛋白酶可能引入疯牛病毒(天然牛胰酶)或口蹄疫病毒(天然猪胰酶)等，将会导致严重的后果，所以利用微生物发酵的方式来获取胰蛋白酶，因其高效性和专一性而逐渐受到人们的青睐。

3、在细胞培养过程中，动物源胰蛋白酶对细胞的消化能力较强，容易导致细胞死亡，降低细胞活率。cn107090427a公开了一种基因重组胰蛋白酶细胞消化液，所述基因重组胰蛋白酶细胞消化液组分为：磷酸氢二钾50-70mg/l，氯化钾350-450mg/l，碳酸氢钠300-400mg/l，氯化钠7000-9000mg/l，七水磷酸氢二钠80-100mg/l，葡萄糖1000-2000mg/l，edta-4na 200-500mg/l，基因重组胰酶1-60mg/l，余量为水。该方案通过引入基因重组胰酶代替动物源胰酶，极大地改善了细胞消化过程中引入动物源胰蛋白酶的不可控因素，但该方案消化后的细胞活率只能维持在90％以上，未能满足细胞的高活率需求。

技术实现思路

1、为了解决对间充质干细胞贴壁培养过程中胰酶消化对细胞造成的损伤，进而影响间充质干细胞的数量和质量的技术问题，本申请提供一种维持细胞高活率的重组胰酶细胞消化液，主要用于间充质干细胞的贴壁消化。

2、本申请使用高浓度缓冲体系，很好地维持细胞消化时的ph稳定，同时，添加泊洛沙姆188，可以有效降低细胞消化时反复吹打等操作对细胞造成的机械性损伤，该成分也有维持细胞膜稳定和修复细胞膜的作用。因此，本申请的重组胰酶细胞消化液极大地提升了细胞消化后的活率，解决了传统胰酶消化细胞后活率降低的问题。

3、第一方面，本申请提供一种维持细胞高活率的重组胰酶细胞消化液，采用如下的技术方案：

4、一种维持细胞高活率的重组胰酶细胞消化液，所述重组胰酶细胞消化液由以下浓度的组分组成：氯化钠5000-8000mg/l，葡萄糖500-1500mg/l，磷酸氢二钠500-1500mg/l，碳酸氢钠100-400mg/l，磷酸二氢钾1000-2000mg/l，氯化钾1000-2000mg/l，edta 0.5-2mm，泊洛沙姆188pro 100-500mg/l，hepes 100-500mg/l，重组胰酶100-500mg/l，其余组分为纯水。

5、hepes是一种含有氨基和羧基的两性离子缓冲剂，它具有稳定的分子结构，呈现中性ph值，并且在室温下表现出良好的热稳定性。由于这些特性，hepes广泛用于需要精确控制酸碱度的生物化学和细胞生物学实验。

6、泊洛沙姆188pro是一种非离子型高分子表面活性剂，主要作乳化剂、增溶剂、基因药物载体等药用辅料，188pro是泊洛沙姆系列辅料中具有较好乳化性和安全性的一种，并且是目前应用于静脉注射的唯一人工的乳化剂。

7、泊洛沙姆188pro可增加细胞膜的通透性，保护细胞膜，增强细胞膜稳定性，降低细胞脆性，并且能够直接嵌入细胞膜脂质层，对细胞进行保护，已广泛用于细胞膜修补治疗的研究，被称为细胞膜的“创口贴”。

8、本申请的维持细胞高活率的重组胰酶细胞消化液，对细胞从贴壁状态转化为悬浮状态起到了很好的保护作用，细胞即使在本申请的重组胰酶细胞消化液下消化15min以上，依旧能使细胞活率维持在97％以上，且完全不影响细胞继续传代的状态，适合细胞大规模生产使用，解决了细胞消化时因反复吹打、消化过度等导致的细胞活率、数量、质量下降的技术问题。

9、在一个具体的实施方案中，所述重组胰酶细胞消化液由以下浓度的组分组成：氯化钠5000mg/l，葡萄糖1500mg/l，磷酸氢二钠1500mg/l，碳酸氢钠400mg/l，磷酸二氢钾2000mg/l，氯化钾2000mg/l，edta 2mm，泊洛沙姆188pro 500mg/l，hepes 400mg/l，重组胰酶500mg/l，其余组分为纯水。

10、在一个具体的实施方案中，所述重组胰酶细胞消化液由以下浓度的组分组成：氯化钠6500mg/l，葡萄糖1000mg/l，磷酸氢二钠1000mg/l，碳酸氢钠300mg/l，磷酸二氢钾1500mg/l，氯化钾1500mg/l，edta 1mm，泊洛沙姆188pro 300mg/l，hepes 300mg/l，重组胰酶350mg/l，其余组分为纯水。

11、在一个具体的实施方案中，所述重组胰酶细胞消化液由以下浓度的组分组成：氯化钠8000mg/l，葡萄糖500mg/l，磷酸氢二钠500mg/l，碳酸氢钠100mg/l，磷酸二氢钾1000mg/l，氯化钾1000mg/l，edta 0.5mm，泊洛沙姆188pro 100mg/l，hepes 100mg/l，重组胰酶100mg/l，其余组分为纯水。

12、第二方面，本申请提供上述维持细胞高活率的重组胰酶细胞消化液的制备方法：采用如下技术方案：

13、本申请维持细胞高活率的重组胰酶细胞消化液制备方法为：取各组分分别溶解后混合溶液，补充纯水至各组分浓度，调节ph值至6.9-7.4，过滤即得所述重组胰酶细胞消化液。

14、第三方面，本申请提供上述重组胰酶细胞消化液在消化间充质干细胞中的应用。

15、综上所述，本申请具有以下有益效果：

16、1.本申请使用高浓度缓冲体系，很好地维持细胞消化时的ph稳定，同时，添加泊洛沙姆188，可以有效降低细胞消化时反复吹打等操作对细胞造成的机械性损伤，该成分也有维持细胞膜稳定和修复细胞膜的作用。因此，本申请的重组胰酶细胞消化液极大地提升了细胞消化后的活率，解决了传统胰酶消化细胞后活率降低的问题。

17、2.本申请的维持细胞高活率的重组胰酶细胞消化液，对细胞从贴壁状态转化为悬浮状态起到了很好的保护作用，细胞即使在本申请的重组胰酶细胞消化液下消化30min以上，依旧能使细胞活率维持在97％以上，且完全不影响细胞继续传代的状态，适合细胞大规模生产使用，解决了细胞消化时因反复吹打、消化过度等导致的细胞活率、数量、质量下降的技术问题。

技术特征：

1. 一种维持细胞高活率的重组胰酶细胞消化液，其特征在于，所述重组胰酶细胞消化液由以下浓度的组分组成：氯化钠5000-8000mg/l，葡萄糖500-1500mg/l，磷酸氢二钠500-1500mg/l，碳酸氢钠100-400mg/l，磷酸二氢钾1000-2000mg/l，氯化钾1000-2000mg/l，edta0.5-2mm，泊洛沙姆188 pro 100-500mg/l，hepes 100-500mg/l，重组胰酶100-500mg/l，其余组分为纯水。

2. 根据权利要求1所述的重组胰酶细胞消化液，其特征在于，所述重组胰酶细胞消化液由以下浓度的组分组成：氯化钠5000mg/l，葡萄糖1500mg/l，磷酸氢二钠1500mg/l，碳酸氢钠400mg/l，磷酸二氢钾2000mg/l，氯化钾2000mg/l，edta 2mm，泊洛沙姆188 pro 500mg/l，hepes 400mg/l，重组胰酶500mg/l，其余组分为纯水。

3. 根据权利要求1所述的重组胰酶细胞消化液，其特征在于，所述重组胰酶细胞消化液由以下浓度的组分组成：氯化钠6500mg/l，葡萄糖1000mg/l，磷酸氢二钠1000mg/l，碳酸氢钠300mg/l，磷酸二氢钾1500mg/l，氯化钾1500mg/l，edta 1mm，泊洛沙姆188 pro 300mg/l，hepes 300mg/l，重组胰酶350mg/l，其余组分为纯水。

4. 根据权利要求1所述的重组胰酶细胞消化液，其特征在于，所述重组胰酶细胞消化液由以下浓度的组分组成：氯化钠8000mg/l，葡萄糖500mg/l，磷酸氢二钠500mg/l，碳酸氢钠100mg/l，磷酸二氢钾1000mg/l，氯化钾1000mg/l，edta 0.5mm，泊洛沙姆188 pro 100mg/l，hepes 100mg/l，重组胰酶100mg/l，其余组分为纯水。

5.一种权利要求1-4中任一项所述的重组胰酶细胞消化液的制备方法，其特征在于，取各组分分别溶解后混合溶液，补充纯水至各组分浓度，调节ph值至6.9-7.4，过滤即得所述重组胰酶细胞消化液。

6.一种权利要求1-4中任一项所述的重组胰酶细胞消化液在消化间充质干细胞中的应用。

技术总结
本申请涉及细胞培养的技术领域，具体公开了一种维持细胞高活率的重组胰酶细胞消化液。该重组胰酶细胞消化液由以下浓度的组分组成：氯化钠5000‑8000mg/L，葡萄糖500‑1500mg/L，磷酸氢二钠500‑1500mg/L，碳酸氢钠100‑400mg/L，磷酸二氢钾1000‑2000mg/L，氯化钾1000‑2000mg/L，EDTA 0.5‑2mM，泊洛沙姆188 PRO 100‑500mg/L，HEPES 100‑500mg/L，重组胰酶100‑500mg/L，其余组分为纯水。本申请的重组胰酶细胞消化液极大地提升了细胞消化后的活率，解决了传统胰酶消化细胞后活率降低的问题。

技术研发人员：谢委翰,陈磊辉,黄彬彬
受保护的技术使用者：中科睿极（海宁）生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/10