适应肾盂肾炎检测的针对UPEC毒力基因的引物和探针、试剂及试剂盒的制作方法

本发明是关于生物检测技术，特别是关于一种适应肾盂肾炎检测的针对upec毒力基因的引物和探针、试剂及试剂盒。

背景技术：

1、尿路感染(urinary tract infection，uti)是全球最常见的细菌感染之一。uti影响所有年龄段，不区分性别和成人或儿童，有研究表明，在uti患者中，男性的发病率和死亡率高于女性；全球估计显示，女孩(2％)和男孩(12％)均经历过不少于30次uti发作，复发率为12％-30％。

2、不可轻视的是正常人的泌尿道通常是无菌的，但它也是最常见的细菌感染部位。一般来说，uti以上行方式发展，从尿道周围定植开始，随后尿道上行进入膀胱，引起膀胱炎，在某些情况下，如果不及时治疗，输尿管上行进入肾脏，形成急性肾盂肾炎。急性肾盂肾炎被认为是最严重的尿路感染，因为它通常会导致肾脏瘢痕形成，进而可能导致不可逆的肾损伤、肾衰竭和/或脓毒症。在超过80％的单纯性急性肾盂肾炎病例中，病原体是泌尿致病性大肠杆菌(uropathogenic escherichia coli，upec)。

3、upec的毒力潜力很大程度上取决于几种毒力因子的存在，使其能够在泌尿道中侵入、定植和存活。已有研究从肾盂肾炎的患者体内分离出不同的毒力基因，发现帮助upec克服宿主防御并建立感染的一些主要毒力因子是i型和p型菌毛(分别由fim和pap操纵子编码)，papgii在临床上与人类急性肾盂肾炎相关，已被证明优先结合球苷或gbo4，这是人类肾脏的主要糖脂同工受体；α-溶血素(由hlya编码)；铁需氧菌素受体(由aer编码)和细胞毒性坏死因子1(由cnf1编码)。已有研究者发现在小鼠中，缺乏特异性毒力基因的upec突变体(i型菌毛、p菌毛、α-溶血素和细胞毒性坏死因子(cnf1))可减轻小鼠肾脏感染。且目前正在开发的新疗法旨在靶向大肠杆菌的粘附表面因子，如菌毛，包括菌毛、铁载体和毒素在内的疫苗靶点也正在研究中。

4、目前，临床上常规检查法主要有镜检、培养、组织病理学诊断、影像学检查以及血清学检查等。但是，这些方法都存在一定的缺陷和局限性：耗时、特异性不高、比较倾向主观判断以及特异性不高等问题，而且通过放射学检查进行鉴别膀胱炎或肾盂肾炎对患者还是有一定的致癌风险，存在覆盖面不够、费用高等问题。随着核酸检测技术的发展成熟，出现了越来越多针对尿路感染病原体的核酸检测技术，依靠核酸检测技术可在几小时内得到病原体及耐药基因的诊断结果，可弥补传统培养法的不足。

5、中国发明专利cn111020028a将xgboost算法运用到upec22种菌毛抗原基因的分类上，并通过xgboost算法建立机器学习模型，对引起尿路感染的upec菌毛抗原基因分布特征进行判断，然而需要专业的人员和较为复杂的流程距离实际应用还有很大的距离；中国发明专利cn101096706b涉及禽致病性大肠杆菌、人尿道致病性大肠杆菌毒力基因表达芯片的研究，基于pcr结合基因芯片检测技术分析pcr扩增产物，可达到同时检测多种病原体的目的。但同样有着成本高，操作繁琐，对人员场地要求高的问题。尤其pcr扩增后需用扩增产物进行下一步基因芯片检测，容易导致pcr产物气溶胶污染，造成假阳性结果，对操作者及操作环境要求高，增加了这些方法的推广难度。多重pcr具有高效率、高通量、低成本的特性而被深入研究，并且被广泛应用于科学研究和疾病诊断等领域。随着生物技术的发展，多重pcr技术在扩增和检测方面已经取得了许多新的突破。然而目前尚未有基于多重qpcr检测upec的多种致病性毒力因子的方法，为肾盂肾炎的诊断提供一个参考，因此，这一领域急需研究和开发一种操作简单、快速准确地定性检测尿道感染病原体的多重pcr检测试剂，检测项目可覆盖引起肾盂肾炎的upec的毒力基因。

6、公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种适应肾盂肾炎检测的针对upec毒力基因的引物和探针、试剂及试剂盒，快速(检测耗时约40min)准确地定性检测尿道感染病原体，为肾盂肾炎的诊断提供一个参考。

2、为实现上述目的，本发明的实施例提供了适应肾盂肾炎检测的针对upec毒力基因的引物和探针，至少包括如下任一：用于检测upec毒力基因fimh的引物和探针：引物序列如seq id no.1～2所示、探针序列如seq id no.3所示；用于检测upec毒力基因papg ii的引物和探针：引物序列如seq id no.4～5所示、探针序列如seq id no.6所示；用于检测upec毒力基因cnf1的引物和探针：引物序列如seq id no.7～8所示、探针序列如seq id no.9所示；用于检测upec毒力基因hlya的引物和探针：引物序列如seq id no.10～11所示、探针序列如seq id no.12所示；用于检测upec毒力基因aer的引物和探针：引物序列如seq idno.13～14所示、探针序列如seq id no.15所示。

3、在本发明的一个或多个实施方式中，还包括针对内参基因β-actin的引物和探针，其至少包括如下任一：引物序列如seq id no.16～17所示、探针序列如seq id no.18所示。

4、优选地，作为一种优化的组合方案，进一步限定的引物和探针组中fimh、papg ii、cnf1、hlya、aer以及β-actin的引物/探针体积比为3：3：4：3：4：3。

5、在本发明的一个或多个实施方式中，探针的5’端标记有荧光基团。各种探针标记有不同的荧光基团。优选荧光基团是市售的，如可以采用fam、vic、rox、cy5、atto425、和cy5.5等，它们的检测波长互不相同，可委托公司合成有标记的探针。

6、在本发明的一个或多个实施方式中，探针的3’端标记有淬灭基团。其中各种探针标记有不同的淬灭基团。优选淬灭基团是市售的，如可以采用bhq1、bhq2、mgb、bhq3等，它们的检测波长互不相同，可委托公司合成有标记的探针。

7、在本发明的一个或多个实施方式中，多重荧光定量pcr检测试剂，至少包括如前述的适应肾盂肾炎检测的针对upec毒力基因的引物和探针。

8、在本发明的一个或多个实施方式中，试剂还包括适量模板dna和扩增缓冲液、dntp、dutp、mgcl2、taq聚合酶、ung酶、ddh2o。

9、在本发明的一个或多个实施方式中，试剂包括，以体积为50μl计：1.0mmol/l-4.5mmol/l的mgcl2，0.1mmol/l-0.4mmol/l的dntp，如前述引物和探针中满足每条引物浓度为0.1-1μm和每条探针浓度为0.1-0.5μm，引物和探针，0.5u-2.5u的taq聚合酶，0.1u-0.5u的ung酶，0.1mmol/l-0.3mmol/l的dutp，25μl的2×扩增缓冲液，以及适量的模板dna，余量用ddh2o补齐。

10、在本发明的一个或多个实施方式中，检测过程中可以采用如下方案，以体积为50μl计：2.5mmol/l的mgcl2，0.2mmol/l的dntp，引物和探针fimh、papg ii、cnf1、hlya、aer以及β-actin的加量分别是0.5μl、0.5μl、0.67μl、0.5μl、0.67μl和0.5μl，2.0u的taq聚合酶，0.2u的ung酶，0.2mmol/l的dutp，25μl的2×扩增缓冲液，以及10μl的模板dna，余量为ddh2o。

11、在本发明的一个或多个实施方式中，试剂中：用于检测upec毒力基因fimh的引物和探针、用于检测upec毒力基因papg ii的引物和探针、用于检测upec毒力基因cnf1的引物和探针、用于检测upec毒力基因hlya的引物和探针、用于检测upec毒力基因aer的引物和探针以及用于检测β-actin基因的引物和探针，每一个基因的两对引物和一条探针的摩尔浓度比均满足：2：2：1。

12、在本发明的一个或多个实施方式中，试剂的pcr程序为：

13、

14、并于60℃收集荧光信号。

15、在本发明的一个或多个实施方式中，试剂盒，包括如前述的适应肾盂肾炎检测的针对upec毒力基因的引物和探针或如前述的多重荧光定量pcr检测试剂。

16、与现有技术相比，根据本发明实施方式的适应肾盂肾炎检测的针对upec毒力基因的引物和探针、试剂及试剂盒，基于多色荧光通道，开发了一种可实现“一管式pcr”技术(taqman探针)同时对多个靶标进行定性检测，约40min的检测时间，大大缩短了时长，能够覆盖引起肾盂肾炎的uepc的毒力基因，可在疾病早期指导精准用药，解决临床诊疗痛点。

17、通过本发明筛选的几对引物/探针无交叉污染、相互不干扰，而且兼容目前常规的市售实时荧光pcr设备，无需另添设备。而且在pcr检测体系中引入ung酶和dutp防污染措施，将可能存在的pcr产物污染充分降解，避免引起的假阳性结果，进一步提高了检测的准确性和特异性。