一种正痘病毒属融合抗原及应用

本发明涉及一种融合抗原，属于多肽。

背景技术：

1、正痘病毒属（orthopoxvirus）包括猴痘病毒（monkeypox virus，mpxv）、天花病毒（variola virus，varv）、牛痘病毒（cowpox virus，cpxv）和痘苗病毒（vaccinia virus，vacv）、鼠痘病毒（ectromelia virus，ectv）等，是一类重要生物危害病原体，对人类健康构成严重威胁（sig transduct target ther. 2022. 7， 373）。尤其是2022年以来，多国猴痘病毒疫情案例出现激增，给全球公共卫生带来危机。

2、截至2023年12月，全球已有116个国家（地区）报告了9.3万例猴痘确诊病例，包含171例死亡病例。目前可用于应对猴痘等正痘病毒引起疫情的疫苗主要包括acam2000和mva-bn等，均为减毒活痘苗病毒疫苗，尚未有更加安全的亚单位疫苗品种获批（nat revimmunol.2022. 22， 597–613）。此外，由于减毒活痘苗病毒疫苗产量限制，其分配存在较大的不平衡性，非洲等发展中国家虽然具有高流行风险，却只获得了较为有限的供应（bmj.2022. 378：o1971）。

3、目前，由于正痘病毒基因组较大（>200k）、表达蛋白种类复杂（>190 orf），且具有两种主要的感染性颗粒，即成熟病毒粒子(mvs)和包膜病毒粒子(evs)，靶标免疫原尚未得到完全确认，限制了其重组疫苗的研发。正痘病毒在基因组水平上具有显著的同源性，并在免疫原方面彼此密切相关。已有研究显示正痘病毒的m1r（l1r）、a35r（a27r）、b6（b5）、a29l（a27l）等具有一定免疫保护效力，可被应用于天花病毒、猴痘病毒等的重组疫苗设计（vaccine. 2010 sep 14：28(40)：6627-36.；front. immunol. 2023. 14：1203410.）。但目前正痘病毒疫苗抗原主要采用哺乳动物细胞、昆虫细胞等真核表达系统制备，并以单一组分的形式联合铝佐剂等使用，其免疫效力存在一定不足，且成本较高、可及性较差。本发明的目的就是提供一种针对正痘病毒属尤其是猴痘病毒的高效，且低成本、具有较高可及性的重组疫苗抗原。

技术实现思路

1、基于上述发明目的，本发明首先提供了一种正痘病毒属融合抗原，所述融合抗原是由正痘病毒属m1r抗原和a35r抗原融合而成，所述m1r抗原的序列如seq id no.1所示，所述a35r抗原的序列如seq id no.2所示，所述m1r抗原和a35r抗原以柔性多肽连接，所述正痘病毒属融合抗原的序列如seq id no.3所示。在本发明中具有该氨基酸序列的正痘病毒属融合抗原被命名为“m1r-a35r”。

2、在另一个优选的实施方案中，所述的正痘病毒属融合抗原还具有n糖基修饰的缺失。

3、在一个更为优选的实施方案中， n糖基修饰的缺失为在m1r抗原发生的n73q和n140q的突变。

4、更为优选地，所述m1r抗原和a35r抗原以柔性多肽连接。

5、又为优选地，所述正痘病毒属融合抗原的序列如seq id no.5所示。在本发明中具有该氨基酸序列的正痘病毒属融合抗原被命名为“m1r-a35r-ndel”。

6、在一个优选的实施方案中，所述正痘病毒属融合抗原为原核表达系统可溶性表达，其中，原核表达系统中的表达载体表达硫氧化还原蛋白，宿主细胞具有trxb和gor基因突变，所述正痘病毒属融合抗原的序列如seq id no.7所示。在本发明中具有该氨基酸序列的正痘病毒属融合抗原被命名为“p-m1r-a35r”。

7、更为优选地，所述表达载体为ptig质粒，所述宿主细胞为大肠杆菌origami(de3)。

8、在又一个优选的实施方案中，所述正痘病毒属融合抗原还与金属硫蛋白3融合，所述正痘病毒属融合抗原的序列如seq id no.9所示。在本发明中具有该氨基酸序列的正痘病毒属融合抗原被命名为“p-mt3-m1r-a35r”。

9、更为优选地，所述表达载体为ptig质粒，所述宿主细胞为大肠杆菌origami(de3)。

10、其次，本发明提供了一种编码上述的正痘病毒属融合抗原的多核苷酸，所述多核苷酸的序列为：seq id no.4、seq id no.6、seq id no.8或者seq id no.10。其中，氨基酸序列如seq id no.3所示的融合抗原m1r-a35r的编码序列如seq id no.4所示，氨基酸序列如seq id no.5所示的融合抗原m1r-a35r-ndel的编码序列如seq id no.6所示，氨基酸序列如seq id no.7所示的融合抗原p-m1r-a35r的编码序列如seq id no.8所示，氨基酸序列如seq id no.9所示的融合抗原p-mt3-m1r-a35r的编码序列如seq id no.10所示。

11、第三，本发明提供了一种含有上述多核苷酸的表达载体。在本发明的一个具体实施方案中，含有序列如seq id no.4或seq id no.6所示的多核苷酸的载体为pcdna3.1真核表达载体，在本发明的另一个具体实施方案中，含有序列如seq id no.8或seq id no.10所示的多核苷酸的载体为ptig质粒。

12、第四，本发明提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞。在本发明的一个具体实施方案中，含有所述pcdna3.1真核表达载体的宿主细胞为expi293f细胞，在本发明另一个具体实施方案中，含有所述ptig质粒的宿主细胞为大肠杆菌origami (de3)。

13、最后，本发明提供了上述的正痘病毒属融合抗原在制备正痘病毒属疫苗中的应用。

14、在一个优选的实施方案中，所述正痘病毒属包括猴痘病毒、天花病毒、鼠痘病毒、马痘病毒、痘苗病毒和牛痘病毒。

15、在另一个优选的实施方案中，所述疫苗包括重组蛋白疫苗、核酸疫苗和病毒载体疫苗。

16、本发明公开了一种正痘病毒属融合抗原，更进一步地，公开了一种正痘病毒属糖基修饰缺失型融合抗原及应用，所述糖基修饰缺失型融合抗原，是在由正痘病毒属m1r和a35r两种保守抗原组成的多价融合抗原基础上，通过引入糖基突变或采用特定表达系统可溶性表达去除抗原蛋白天然的n糖基修饰后制备获得。相比于天然糖基修饰型融合抗原，该糖基修饰缺失型融合抗原在联合铝佐剂和/或分子内佐剂mt3后，可激发针对正痘病毒属更为高效的免疫反应，在单针、低剂量免疫下100%保护小鼠免受致死剂量的鼠痘病毒攻击，有望成为一种高效、低成本、可及性较强的正痘病毒属重组蛋白疫苗。

17、相比于现有技术正痘病毒属重组疫苗，本发明所提供的融合抗原包含了正痘病毒属中两种重要的保守抗原，并通过缺失糖基修饰在免疫效力方面得到了显著的提升，且具有成本较低、单针起效、可及性更强等优势，具有较好的推广应用潜力。

18、1）免疫谱更广泛

19、本发明提供的融合抗原包含了正痘病毒属m1r和a35r这两种重要保守抗原，分别位于成熟病毒颗粒（mvs）和包膜病毒颗粒（evs）。通过结构建模确定了m1r与a35r的连接顺序，即m1r抗原位于融合蛋白的n端，a35r位于融合蛋白的c端，以柔性连接肽相连，所获得双价融合抗原m1r-a35r构象更为稳定，且两个抗原蛋白间表位相互遮蔽影响较少，可同时激发针对两种类型病毒颗粒的免疫应答，免疫谱更加广泛。

20、2）免疫效力更强

21、通过对m1r-a35r双价融合抗原进行糖基质谱鉴定，首次鉴定到两个关键n糖基修饰位点（n73、n140），通过引入突变氨基酸（n73q、n140q），去除这两个关键n糖基修饰，获得了真核细胞中表达制备的n糖基修饰缺失型融合抗原m1r-a35r-ndel。相比于天然糖基修饰型融合抗原，该糖基修饰缺失型融合抗原抗原在联合铝佐剂后，可激发针对正痘病毒属更为高效的免疫反应（特异性抗体水平增强4-12倍）。

22、3）成本更低、单针起效、可及性更强

23、为了获得n糖基修饰缺失型融合抗原，首先尝试采用了常规原核表达系统大肠杆菌bl21和常规表达载体pet进行p-m1r-a35r融合蛋白的表达，发现无法获得可溶性、正确构象的n糖基修饰缺失型融合抗原，全部为包涵体形式，无法实现预期目的。

24、选择利用特定原核表达系统即大肠杆菌origami (de3)作为宿主细胞，该宿主细胞在trxb和gor基因上同时含有突变，菌株能够更加高效地在胞内生成二硫键，有助于表达含二硫键的、无n糖基化修饰的活性蛋白。同时，采用原核表达载体ptig，该载体带有硫氧化还原蛋白可辅助目的蛋白正确折叠，获得了原核细胞中可溶性表达的n糖基修饰缺失型融合抗原p-m1r-a35r。相比于天然糖基修饰型融合抗原，该糖基修饰缺失型融合抗原在联合铝佐剂后，可激发针对正痘病毒属更为高效的免疫反应。进一步，将分子内佐剂mt3与融合抗原联合，所获得的联合抗原p-mt3-m1r-a35r可产生更强的免疫效力，在单针免疫下即可保护小鼠免受致死剂量的正痘病毒属鼠痘病毒攻击，可及性较好，成本更低。