利用清酒乳杆菌制备PDRN的方法和应用与流程

本技术涉及生物发酵，尤其涉及利用清酒乳杆菌制备pdrn的方法和应用。

背景技术：

1、pdrn，多聚核苷酸，是一种源自鲑鱼精巢细胞的由多个碱基对通过磷酸二酯键连接而成的生物大分子物质，其本质是由不同片段大小的鲑鱼遗传物质组成的一种混合产物。早在1952年，意大利mastelli公司根据渔民使用鲑鱼精巢处理伤口的现象从鲑鱼的精巢细胞中提取出不同大小的核酸片段（pdrn），并对其药理活性等相关性质进行了研究。实验结果表明，雄性鲑鱼精巢细胞中的核酸碎片（pdrn）可以显著促进人体细胞再生，迅速促进伤口愈合并减少疤痕生成。在后续的不断研究中，pdrn又被陆续发现存在抗炎、组织修复、促进血管生成、抗缺血以及改善糖尿病足的作用。

2、现代工业大多从深海鲑鱼的精巢细胞中提取pdrn原料，例如专利cn107287186a公开的从鱼类的精液分离多脱氧核糖核苷酸的方法、专利cn110747194a公开的一种小分子多聚脱氧核糖核苷酸的制备与应用、专利cn112315836a公开的一种高效的外用pdrn的制备方法及其应用和专利cn115074357a公开的一种多聚脱氧核糖核苷酸的制备方法及应用等等。上述工艺虽然是一直以来获取pdrn原料的主要途径，但是伴随海洋渔业资源的不断枯竭，从鲑鱼精巢细胞中提取pdrn已经难以满足新时代越来越旺盛的pdrn原料需求。此外，海洋生物的重金属富集、染色体畸变和基因突变等问题也对鲑鱼精pdrn原料的安全性造成了极大影响。

3、清酒乳杆菌（ lactobacillus sakei）是一种天然发酵产物中的乳酸菌（泡菜、臭鳜鱼等），主要用途为发酵泡菜、果蔬制品等。目前未有采用清酒乳杆菌生产pdrn的前例。

技术实现思路

1、本发明针对鲑鱼精多聚核苷酸（pdrn）产物安全性差、生态不友好以及可持续性发展能力差的问题，本技术提供了一种从清酒乳杆菌（ lactobacillus sakei）中天然提取pdrn的方法。

2、一方面，本技术提供了一种清酒乳杆菌（ lactobacillus sakei），所述清酒乳杆菌为清酒乳杆菌 lactobacillus sakeils-01，其保藏于中国典型培养物保藏中心（cctcc），保藏编号为cctcc no：m 20232285。

3、本发明筛选到了一株高活性且适于制备pdrn的清酒乳杆菌，即清酒乳杆菌 lactobacillus sakeils-01，16s rdna序列如seq id no .1所示。其早在2014年就被卫健委批准纳入《新食品原料名单》，是可食用菌种，因此本技术首次利用清酒乳杆菌生产pdrn，为pdrn生产提供了一种新材料和新途径。

4、另一方面，本技术还提供了包含所述清酒乳杆菌的菌剂。

5、优选的，所述清酒乳杆菌为清酒乳杆菌ls-01，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 20232285。

6、优选的，所述菌剂含有活菌数≥106cfu/g的上述清酒乳杆菌干菌体和/或湿菌体。

7、本领域技术人员可根据清酒乳杆菌通用培养方法培养本技术所述清酒乳杆菌。

8、另一方面，本技术还提供了一种pdrn的制备方法，所述方法包括如下步骤：

9、步骤一、收集清酒乳杆菌菌体裂解制备菌体裂解液；

10、步骤二、将所述菌体裂解液进行盐析制备盐析清液；

11、步骤三、向所述盐析清液中加入有机溶剂沉淀制备粗产品；

12、步骤四，将所述粗产品脱水干燥获得pdrn。

13、进一步地，所述方法包括如下步骤：

14、步骤一、收集清酒乳杆菌菌体，重悬菌体后添加酶裂解，高压均质制备菌体裂解液；

15、步骤二、向所述菌体裂解液中加入盐和蛋白变性剂进行盐析，制备盐析清液；

16、步骤三、向所述盐析清液中加入有机溶剂沉淀制备粗产品；

17、步骤四，将所述粗产品脱水干燥获得pdrn。

18、优选地，所述步骤还包括将清酒乳杆菌或其菌剂发酵制备发酵液。

19、本领域技术人员可根据清酒乳杆菌通用培养方法培养制备本技术所述清酒乳杆菌发酵液。

20、优选的，所述清酒乳杆菌为清酒乳杆菌ls-01，其保藏于中国典型培养物保藏中心（cctcc），保藏编号为cctcc no：m 20232285。

21、优选的，清酒乳杆菌发酵液的制备方法包括如下步骤：

22、步骤一、将清酒乳杆菌或其菌剂接种于培养基中，25℃-40℃，100-200 rpm培养1-12 h，获得种子液；优选的，37℃，160 rpm，培养8 h；

23、步骤二、将所述种子液接种于培养基中，接种量为1%-10%，25℃-40℃培养10-20 h即得发酵液；优选的，37℃培养16 h；优选的，接种量为4％。

24、更优选的，所述培养基为 mrs液体培养基。

25、所述清酒乳杆菌或其种子液培养温度可选自25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃中任一数值。

26、所述清酒乳杆菌或其种子液培养时间可选自1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8h、9 h、10 h、11 h、12 h中任一数值。

27、所述种子液培养转速可选自100 rpm、110 rpm、120 rpm、130 rpm、140 rpm、150rpm、160 rpm、170 rpm、180 rpm、190 rpm、200 rpm中任一数值。

28、优选的，所述接种量可选自1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%中任一数值。

29、所述发酵液培养温度可选自25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃中任一数值。

30、所述发酵液培养时间可选自10 h、11 h、12 h、13 h、14 h、15 h、16 h、17 h、18 h、19 h、20 h中任一数值。

31、优选的，所述步骤一中，收集菌体的方法为离心收集。

32、优选的，所述步骤一中，重悬菌体的溶剂为缓冲液。

33、在一种具体的实施方式中，所述缓冲液为te缓冲液。

34、进一步地，所述酶包括但不限于产自极暗黄链霉菌的labiase、变溶菌素、溶葡球菌酶、消色肽酶等溶菌酶以及木瓜蛋白酶中的一种或多种，所述酶添加的终浓度为0.2-0.5mg/ml；

35、和/或，所述盐选自氯化钠、乙酸钾、乙酸钠、硫酸铵、硫酸钠中的一种或多种，所述盐的添加终浓度为1-5 m；

36、和/或，所述蛋白变性剂选自盐酸胍、苯酚和表面活性剂中的一种或多种，以菌体裂解液质量百分比计，所述蛋白变性剂添加浓度为0.5%-2%；

37、和/或，所述有机溶剂选自乙醇、甲醇、异丙醇中的一种或多种；

38、和/或，所述高压均质包括压力800-1200 bar；和/或，所述裂解条件包括：25℃-40℃，恒温孵育1-5 h；和/或，所述盐析条件包括：40℃-80℃孵育1-3 h。

39、优选的，所述酶包括任何可以破坏革兰氏阳性菌细胞壁的酶，可以包括但不限于产自极暗黄链霉菌的labiase、变溶菌素、溶葡球菌酶、消色肽酶等溶菌酶以及木瓜蛋白酶任一种或多种，所加酶的浓度为0.2-0.5 mg/ml；优选的，0.2 mg/ml，0.3 mg/ml，0.4 mg/ml，0.5 mg/ml中任一数值。

40、优选的，所述步骤一中裂解的步骤，包括：加入酶后25℃-40℃，恒温孵育1-5 h。

41、恒温孵育温度可选自25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃中任一数值。

42、恒温孵育时间可选自1 h、2 h、3 h、4 h、5 h中任一数值。

43、优选的，所述步骤一中，高压均质采用高压均质仪实现，其压力为800-1200bar，循环次数为1-5次。

44、均质裂解工艺压力可选自800 bar、850 bar、900 bar、950 bar、1000 bar、1500bar、1100 bar、1150 bar、1200bar以及之间任一值。

45、其中，高压均质的循环次数可以为1次、2次、3次、4次、5次及以上，只要获得最终产物pdrn即可，因此此处不再对其循环次数和相关设备仪器进行限定。

46、步骤二中，所加入盐选自氯化钠、乙酸钾、乙酸钠、硫酸铵、硫酸钠中的一种或多种；优选的，加入盐为氯化钠，终浓度为1-5 m。

47、氯化钠终浓度可以为1m、1.5m、2m、2.5m、3m、3.5m、4m、4.5m、5m以及之间任一值。

48、优选的，所述蛋白变性剂选自盐酸胍、苯酚和表面活性剂中的一种或多种，其中表面活性剂包括十二烷基硫酸钠、十二烷基肌氨酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚、聚氧乙炔失水山梨醇月桂酸酯、聚氧乙炔失水山梨醇单棕榈酸酯、聚氧乙炔失水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙炔失水山梨醇三硬脂酸酯、聚氧乙炔失水山梨醇单油酸酯中的一种或多种；优选的，所述蛋白变性剂为十二烷基硫酸钠，以菌体裂解液质量百分比计，添加浓度为0.5%-2%。

49、可以理解的是，本领域技术人员可选择采用已知蛋白变形剂进行该部分处理，只要使得最终产物实现盐析即可，因此此处不再对其具体方法和仪器进行限定。

50、以菌体裂解液质量百分比计，十二烷基硫酸钠的浓度可以为0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%以及之间任一值。

51、优选的，所述步骤二中盐析的步骤，包括：加入盐和蛋白变性剂后40℃-80℃孵育1-3 h。

52、恒温孵育温度可选自40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃中任一数值。

53、恒温孵育时间可选自1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h中任一数值。

54、优选的，所述步骤二中还包括离心取上清液获得盐析清液的步骤。

55、进一步地，所述有机溶剂选自乙醇、甲醇、异丙醇中的一种或多种。

56、优选的，所述有机溶剂为乙醇；更优选的，无水乙醇。

57、优选的，所述盐析清液与有机溶剂的质量比为1:（1-5）；更优选的，1:2.5。

58、所述盐析清液与有机溶剂的质量比可选自1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5中任一数值。

59、优选的，所述沉淀时间为20-60 min；更优选的，30 min。

60、所述沉淀时间可选自20 min、21 min、22 min、23 min、24 min、25min、26 min、27min、28 min、29 min、30 min、31 min、32 min、33 min、34 min、35 min、36 min、37min、38min、39 min、40 min、41 min、42min、43 min、44min、45 min、46 min、47 min、48 min、49min、50 min、51 min、52 min、53 min、54 min、55 min、56 min、57 min、58 min、59 min、60min中任一数值。

61、优选的，所述步骤二中还向盐析清液中加入乙酸钠；更优选的，所述乙酸钠的浓度为0.1-0.5 m；更优选的，0.3 m。

62、所述乙酸钠的浓度可选自0.1 m、0.2 m、0.3 m、0.4 m、0.5 m中的任一数值。

63、优选的，所述步骤三中还包括漂洗离心的步骤，弃去离心后的上清液即得粗产品。

64、优选的，所述步骤四中脱水干燥包括：脱水处理、真空干燥的步骤。

65、可以理解的是，本领域技术人员可选择采用已知干燥技术进行该部分处理，只要使得最终产物实现脱水干燥即可，因此此处不再对其具体方法进行限定。

66、在一种优选的实施方式中，一种pdrn的制备方法，所述方法包括如下步骤：

67、步骤一、将清酒乳杆菌或其菌剂接种于培养基中，25℃-40℃，100-200 rpm培养1-12 h，获得种子液；所述清酒乳杆菌为清酒乳杆菌ls-01，其保藏于中国典型培养物保藏中心（cctcc），保藏编号为cctcc no：m 20232285；将所述种子液接种于培养基中，接种量为1%-10%，25℃-40℃培养10-20 h即得发酵液；

68、步骤二、离心收集所述发酵液中菌体，缓冲液重悬菌体后，添加酶进行恒温孵育，所述加入酶的终浓度为0.2-0.5 mg/ml，25℃-40℃，恒温孵育1-5 h，再进行均质裂解工艺进行菌体破碎，所述均质裂解工艺采用高压均质仪进行，所述均质工艺压力为800-1200bar，循环1-5次，制备高压均质液。

69、步骤三、向制备得到的高压均质液中加入盐和表面活性剂进行盐析，所述盐为氯化钠，加入终浓度为1-5 m；蛋白变性剂为十二烷基硫酸钠，所述十二烷基硫酸钠加入终浓度为0.5-2%；加入盐和蛋白变性剂后40℃-80℃孵育1-3 h后，离心收集上清液，制备盐析清液；

70、步骤四、向所述盐析清液中加入无水乙醇和乙酸钠，所述盐析清液与无水乙醇的质量比为1:（1-5），所述乙酸钠的浓度为0.1-0.5 m，沉淀20-60 min，漂洗离心制备粗产品；

71、步骤五，将所述粗产品脱水干燥获得pdrn；

72、所述培养基为 mrs液体培养基。

73、另一方面，本技术还提供了所述清酒乳杆菌在制备或生产pdrn中的应用。

74、另一方面，本技术还提供了一种pdrn，所述pdrn中gc含量为39%-42%；优选的，所述pdrn中gc含量为39.5%-41.5%。

75、优选的，所述pdrn中gc含量可选自39%、39.5%、40%、40.5%、41%、41.5%、42%以及之间任一数值。

76、进一步地，所述pdrn分子量为100 kda-500 kda；优选的，所述pdrn分子量为150kda-350 kda；

77、优选的，所述pdrn分子量可选自100 kda、110 kda、120 kda、130 kda、140 kda、150 kda、160 kda、170 kda、180 kda、190 kda、200 kda、210 kda、220 kda、230 kda、240kda、250 kda、260 kda、270 kda、280 kda、290 kda、300 kda、310 kda、320 kda、330 kda、340 kda、350 kda、360 kda、370 kda、380 kda、390 kda、400 kda、410 kda、420 kda、430kda、440 kda、450 kda、460 kda、470 kda、480 kda、490 kda、500 kda中以及之间任一数值。

78、进一步地，以质量百分比计，所述pdrn中蛋白质含量小于等于0.5%。

79、优选的，所述pdrn中蛋白质含量小于等于0.4%、0.3%、 0.2%、0.1%、0.05%、0.01%和0%以及之间任一值。

80、优选的，所述pdrn呈现白色或类白色颗粒或粉末。

81、优选的，所述pdrn溶解性好，其1 g产品在30 min内完全溶解于1 l水中。

82、更优选的，所述的溶解时间可以为0.5min、1min、1.5min、2min、2.5min、3min、3.5min、4min、4.5min、5min、5.5min、6min、6.5min、7min、7.5min、8min、8.5min、9min、9.5min、10min、10.5min、11min、11.5min、12min、12.5min、13min、13.5min、14min、14.5min、15min、15.5min、16min、16.5min、17min、17.5min、18min、18.5min、19min、19.5min、20min、20.5min、21min、21.5min、22min、22.5min、23min、23.5min、24min、24.5min、25min、25.5min、26min、26.5min、27min、27.5min、28min、28.5min、29min、29.5min、30min以及之间任一值。

83、优选的，所述的pdrn 中核酸含量大于等于96.3%，具体可为96.3%、96.4%、96.5%、96.6%、96.7%、96.8%、96.9%、97.0%、97.1%、97.2%、97.3%、97.4%、97.5%、97.6%、97.7%、97.8%、97.9%、98.0%、98.1%、98.2%、98.3%、98.4%、98.5%、98.6%、98.7%、98.8%、98.9%、99.0%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、100.0%以及之间任一值。

84、优选的，所述pdrn的纯度（od260/od280值）为1.8-2.0。

85、所述pdrn的纯度（od260/od280值）可以为1.8、1.9、2.0以及之间任一值。

86、所述的pdrn可以含量少量的pn、水等物质，所述的pn含量小于等于12%，其不会对pdrn功效等产生实质影响。

87、另一方面，本技术还提供了一种组合物，所述组合物包含所述pdrn；优选的，所述组合物还包含辅料。

88、本技术还可以添加辅料，所述辅料可以是适当的溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、ph值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。

89、本技术的组合物可以通过通用方法来制备，其中可加入一种或多种稀释剂或载体，例如水剂、丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、锭剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂等。

90、本技术的组合物可以制备成本领域通常制备的任何制剂。例如，它可以配制成霜剂、乳液、乳液、面膜、粉底、医疗器械、头发化妆品等制剂。具体地,皮肤乳液、皮肤软化剂、水光针、皮肤爽肤水、收敛剂、化妆水、乳液、保湿乳液、营养乳液、按摩霜、营养霜、保湿霜、护手霜、粉底、精华素、营养精华、面膜、肥皂、洁面泡沫、洁面乳、洁面霜、润肤露或沐浴乳。

91、本技术的组合物中，除了作为必需成分的pdrn之外，可以根据需要混合通常在化妆品中配制的其他成分。例如油脂成分、保湿剂、表面活性剂、有机颜料、无机颜料、紫外线吸收剂、防腐剂、杀菌剂、抗氧化剂、植物提取物、ph调节剂、醇类、色素、香料、血液循环促进剂、清凉剂、止汗剂或可以混合纯净水。

92、另一方面，本技术还提供了所述的清酒乳杆菌或所述的菌剂或所述的pdrn或所述的组合物在制备促进细胞增殖和/或促进胶原蛋白生成的产品中的应用。

93、另一方面，本技术还提供了所述的清酒乳杆菌或所述的菌剂或所述的pdrn或所述的组合物在促进细胞增殖和/或促进胶原蛋白生成中的应用。

94、另一方面，本技术还提供了所述的清酒乳杆菌或所述的菌剂或所述的pdrn或所述的组合物在制备抗炎舒缓和/或修复皮肤屏障受损产品中的应用。

95、另一方面，本技术还提供了所述的清酒乳杆菌或所述的菌剂或所述的pdrn或所述的组合物在抗炎舒缓和/或修复皮肤屏障受损中的应用。

96、本发明具有如下有益效果：

97、1、本发明首次从清酒乳杆菌（ lactobacillus sakei）中提取天然多聚核苷酸pdrn，解决了鲑鱼精pdrn安全性不稳定、生态不友好以及可持续发展性差的问题，为pdrn的生产提供了一种新途径。

98、2、本发明还提供了一种从清酒乳杆菌中天然提取pdrn的方法，该方法

99、从菌种培养至上罐发酵全程闭环管理、安全可控，并且清酒乳杆菌发酵过程中不产废气、废水和废渣等污染物，发酵液、菌体碎片等液体残留和渣滓经加工后还可作为动物饲料，生产过程生态友好、可持续发展能力强。

100、3、采用本发明记载方法制备pdrn中的gdna中gc%与人的gc%相似性99%以上，比鲑鱼来源的pdrn更接近人体gc%，安全性和功效性更高，且相比现有技术中在鲑鱼精液中提取pdrn，清酒乳杆菌源pdrn制备方法更加简单便捷。

101、4、单一来源的鲑鱼pdrn产量易受原材料限制，原材料的不稳定性也限制其应用范围，对比鲑鱼动辄3-7年的生长周期，本发明中清酒乳杆菌发酵周期极短，从接种至发酵结束仅需16 h左右，并且具有生长环境可控、产物纯净、发酵成本低以及可持续发展能力强等等诸多优点，且可食用菌种来源使清酒乳杆菌pdrn未来应用场景更为广阔。