一种王浆蛋白降糖肽粉的制备方法及其应用

本发明涉及功能肽及特医食品加工，具体涉及一种王浆蛋白降糖肽粉的制备方法及其应用。

背景技术：

1、2型糖尿病（t2dm）是一种慢性代谢疾病，影响超过90%的糖尿病患者，其中生活节奏不规律和工作压力增加是t2dm发病的重要因素。α-葡萄糖苷酶被认为预防和治疗t2dm的有效靶点，其主要分布在小肠上皮绒毛膜刷状沿上，并负责分解食物中的多糖，如淀粉和糖苷，生成可被小肠吸收的葡萄糖和其他单糖。因此，通过抑制α-葡萄糖苷酶有助于控制和降低血糖。

2、与传统α-葡萄糖苷酶抑制剂相比，通过对蛋白质进行酶解处理获得具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的多肽更加绿色、健康和安全，这类原料不仅可以做普通食品直接食用，还可以作为食品辅料应用于降糖肽粉或功能食品的研发中。

3、王浆是昆虫食品领域中备受推崇的高品质功能性蛋白质来源，蜂王浆的关键活性成分占相当大的比例(超过其总蛋白质含量的80%)，被称为王浆蛋白。近年来，许多研究报道主要集中在王浆的生物活性上，特别是其作为功能性食品在增强免疫和抗衰老方面备受市场推崇和消费者喜爱。然而，王浆蛋白对温度和酸极为敏感，其在食品加工与贮运过程中会自发聚集形成纤维状聚集体，进一步其被胃肠道消化，制约了王浆蛋白的营养吸收、高值化利用和功能性食品开发。

4、当前，王浆蛋白降糖肽粉的制备方法尚未见研究报道，其深度加工利用方面基本处于停滞状态。现有发明专利cn108949887b、cn107868810b、cn105713943b分别提供了大豆降糖肽粉、海地瓜活性肽粉、莜麦降糖肽粉的制备方法，这些方法中的酶解工艺仅限于简单的单一或双酶处理，而没有考虑逐步多酶联用以提高肽粉的降糖效率，且现有专利尚未对肽粉中降糖成分进行鉴定。

技术实现思路

1、针对现有技术不足，本发明提供一种王浆蛋白降糖肽粉及其制备方法及其应用，该方法以抑制α-葡萄糖苷酶的活性作为目标，通过逐步多酶联用技术以提高肽粉的降糖效率，促进王浆蛋白的深度加工和功能研发。同时，本发明还鉴定王浆蛋白降糖肽粉中的降糖成分，这为王浆蛋白降糖肽粉的功效研究提供参考价值和有力保障。

2、为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：

3、一种王浆蛋白降糖肽粉的制备方法，所述王浆蛋白降糖肽粉的制备方法包括以下步骤：

4、s1、蜂王蛋白预处理：选取蜂王蛋白溶于水后搅拌混合均匀，再调节ph至3-9，得预处理蛋白溶液；

5、s2、初步酶解：将碱性蛋白酶加入至预处理蛋白溶液中进行初步消化酶解，得初步酶解料备用；

6、s3、二次酶解：向上述初步酶解料中加入氯化钠和盐酸，ph调节在1-3，后加入胃蛋白酶继续处理酶解，得二次酶解料备用；

7、s4、三次酶解：向上述二次酶解料中加入氢氧化钠和磷酸二氢钾，ph调节在6.5-9，再加入胰蛋白酶继续酶解消化，得三次酶解料；

8、s5、对上述三次酶解料沸水使酶灭活，后离心冻干，得王浆蛋白降糖肽粉；

9、s6、对上述王浆蛋白降糖肽粉采用计算酶解肽段，结合糖苷酶肽库和lbspeppredictor工具对关键功效肽段进行鉴定。

10、优选的，所述步骤s1中蜂王蛋白溶于水的料液比为10~50∶100-500，且搅拌混合均匀的方式为使用磁力搅拌在400~1200 r/min下搅拌1~30分钟使其充分水合。

11、优选的，所述步骤s2中碱性蛋白酶的添加酶量为0.5~5 mg/ml，且酶解条件为在ph在8.5-9.5，温度在35-50℃，酶解2-6h。

12、优选的，所述步骤s3中胃蛋白酶的添加酶量为0.5~10 mg/ml，且酶解条件为在35-50℃温度条件下酶解2-6h。

13、优选的，所述步骤s4中胰蛋白酶的添加量为10mg/ml，且胰蛋白酶酶解的温度为35-50℃，酶解时间为2-6h。

14、优选的，所述步骤s5中离心冻干的方式为以6000~12000 rpm的离心速度进行离心10~45min，后去除沉淀将澄清上清液冻干。

15、优选的，所述步骤s6中计算酶解肽段是将新鲜王浆的蛋白组学信息依次导入到peptidemass工具获得序列长度小于5~10的小分子肽库。

16、优选的，所述步骤s6中糖苷酶肽库包括通过实验证实的降糖肽，所述糖苷酶肽库其架构为：

17、dataset={“sequence”:x,

18、“activate”:y,

19、“label”:q},

20、其中

21、x=[x1,x2,x3,x4,...,xi],y=[y1,y2,y3,y4,...,yi],q=[q1,q2,q3,q4,...,qi],

22、其中，i表示数据库中肽段的数量；x1表示第一条肽段，其序列表达20种氨基酸的任一两者及多种组合；y1表示第一条肽段对应的α-糖苷酶抑制率值，其具体指α-糖苷酶抑制肽对α-糖苷酶的抑制活性，具体为被测量的酶活的半抑制浓度，即ic50值；q1表示第一条肽段的活性分类。

23、优选的，所述lbspeppredictor为使用cnn和transformer算法开发的高活性α-糖苷酶抑制肽预测工具。

24、且王浆蛋白降糖肽粉应用于制备功能食品。

25、本发明提供一种王浆蛋白降糖肽粉及其制备方法及其应用，与现有技术相比优点在于：

26、本发明以抑制α-葡萄糖苷酶的活性作为目标，通过逐步多酶联用技术以提高肽粉的降糖效率，促进王浆蛋白的深度加工和功能研发。同时，本发明还鉴定王浆蛋白降糖肽粉中的降糖成分，这为王浆蛋白降糖肽粉的功效研究提供参考价值，为王浆蛋白降糖肽粉品质保障提供技术可控方案。

技术特征：

1.一种王浆蛋白降糖肽粉的制备方法，其特征在于，所述王浆蛋白降糖肽粉的制备方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种王浆蛋白降糖肽粉的制备方法，其特征在于：所述步骤s1中蜂王蛋白溶于水的料液比为10~50∶100-500，且搅拌混合均匀的方式为使用磁力搅拌在400~1200 r/min下搅拌1~30分钟使其充分水合。

3.根据权利要求1所述的一种王浆蛋白降糖肽粉的制备方法，其特征在于：所述步骤s2中碱性蛋白酶的添加量为0.5~5 mg/ml，且酶解条件为在ph在8.5-9.5，温度在35-50℃，酶解2-6h。

4.根据权利要求1所述的一种王浆蛋白降糖肽粉的制备方法，其特征在于：所述步骤s3中胃蛋白酶的添加酶量为0.5~10 mg/ml，且酶解条件为在35-50℃温度条件下酶解2-6h。

5.根据权利要求1所述的一种王浆蛋白降糖肽粉的制备方法，其特征在于：所述步骤s4中胰蛋白酶的添加量为10mg/ml，且胰蛋白酶酶解的温度为35-50℃，酶解时间为2-6h。

6.根据权利要求1所述的一种王浆蛋白降糖肽粉的制备方法，其特征在于：所述步骤s5中离心冻干的方式为以6000~12000 rpm的离心速度进行离心10~45min，后去除沉淀将澄清上清液冻干。

7.根据权利要求1所述的一种王浆蛋白降糖肽粉的制备方法，其特征在于：所述步骤s6中计算酶解肽段是将新鲜王浆的蛋白组学信息依次导入到peptidemass工具获得序列长度小于5~10的小分子肽库。

8.根据权利要求7所述的一种王浆蛋白降糖肽粉的制备方法，其特征在于：所述步骤s6中糖苷酶肽库包括通过实验证实的降糖肽，所述糖苷酶肽库其架构为：

9.根据权利要求8所述的一种王浆蛋白降糖肽粉的制备方法，其特征在于：所述lbspeppredictor为使用cnn和transformer算法开发的高活性α-糖苷酶抑制肽预测工具。

10.一种如权利要求1-6任一所述的王浆蛋白降糖肽粉的制备方法所制备的王浆蛋白降糖肽粉应用于制备功能食品。

技术总结
本发明提供一种王浆蛋白降糖肽粉的制备方法及其应用，涉及功能肽及特医食品领域。所述王浆蛋白降糖肽粉的制备方法主要为以新鲜王浆中的蛋白质作为原料，依次进行搅拌、调酸碱、添酶、离心，对酶解液上清进行冻干获得王浆肽粉；进一步采用多种食品酶联用技术提升王浆肽粉对α‑糖苷酶的抑制活性；采用计算酶解肽段，结合糖苷酶肽库和LBSPepPredictor工具对关键功效肽段进行鉴定。本发明克服了现有技术的不足，制备的王浆蛋白降糖肽粉与未处理前相比对α‑糖苷酶抑制率提高了8.59倍，且远优于单酶或双酶，并且鉴定7种高活性的降糖肽，为王浆蛋白资源的深度开发利用及降糖功效产品研究提供理论指导，明确其功效肽为其在功能性及特医食品领域中的应用提供依据。

技术研发人员：田文礼,彭文君,潘飞,方小明,李相昕,陈华磊,邹旭,张俊
受保护的技术使用者：中国农业科学院蜜蜂研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/3/31