一种基于CRISPR/Cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法和应用与流程

本发明涉及生物检测，特别涉及一种grna组合物及其crispr检测系统和应用。

背景技术：

1、crispr/cas系统是一种存在于大多数细菌和古菌中的适应性免疫系统，其利用编码在crispr位点中的引导rna（grna）指导crispr相关的内切酶（cas）识别和切割特定的外源核酸序列，以保护其免受病毒的感染。

2、最初，研究者在体外模拟crispr过程，利用特定的grna引导cas切割目标基因，从而实现目标靶基因的高效编辑。随后，研究者发现部分crispr/cas系统，如crispr/cas12，能在靶向切割目标dsdna（顺式切割）的同时，非特异地高效切割体系中的ssdna（反式切割）。这种特性促使crispr技术被迅速扩展到基因检测领域。在一个典型的crispr核酸检测应用中，通常利用前置核酸扩增技术（如重组酶聚合酶扩增，rpa）指数化放大痕量的目标核酸，随后利用grna/cas复合物特异性识别目标扩增子，从而激活其反式切割活性并裂解淬灭的寡核苷酸探针，释放可检测的荧光信号，实现对目标基因的特异性检测。然而，对于当前基于crispr的核酸检测技术，核酸扩增与crispr检测通常分步进行，反应体系复杂、耗时，且极容易导致气溶胶污染，不利于实际应用。

技术实现思路

1、本发明的主要目的是提出一种grna组合物及其crispr检测系统和应用，旨在实现一步crispr核酸检测。

2、为实现上述目的，本发明提出一种基于crispr/cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法，用于检测待测样品中的目标基因序列，包括以下步骤：

3、s10、将反应液a和反应液b混合，获得混合溶液；

4、s20、将待测样品加入所述混合溶液中，孵育后，检测荧光信号，其中，

5、当荧光信号的相对荧光单位值不小于预设值时，判断所述待测样品中含有目标基因；

6、当荧光信号的相对荧光单位值小于预设值时，判断所述待测样品中不含有目标基因；

7、其中，所述反应液a包括扩增酶体系，所述反应液b包括grna组合物、cas蛋白和信号探针，所述grna组合物包括至少一种非常规grna。

8、可选地，所述目标基因序列包括is6110、is1081、esxb、gryb、rpob、katg、inha、rpsl、rrs、gyra、gyrb、embb、eis、pnca或rfbe等。

9、可选地，所述目标基因序列为 is6110；

10、所述非常规grna包括grna1、grna2、grna3、grna4和grna5中的至少一种；其中，

11、所述grna1的序列如seq id no.2所示；

12、所述grna2的序列如seq id no.3所示；

13、所述grna3的序列如seq id no.4所示；

14、所述grna4的序列如seq id no.5所示；

15、所述grna5的序列如seq id no.6所示。

16、可选地，所述grna组合物还包括至少一种常规grna；

17、所述至少一种常规grna包括grna0，所述grna0的序列如seq id no.1所示。

18、本还发明提出一种crispr检测系统，包括如前述的grna组合物、信号探针以及cas蛋白。

19、可选地，所述扩增酶体系包括扩增缓冲液、引物对、氯化镁和酶；和/或，

20、所述反应液b还包括crispr缓冲液。

21、可选地，所述酶包括rpa酶，所述扩增缓冲液为rpa缓冲液，所述rpa缓冲液包括50mm tris、50 mm kac、5 mm dtt、10 mm at、2 mm dntps和30 mm磷酸肌酸；和/或，

22、所述crispr缓冲液包括50 mm nacl、10 mm tris-hcl、10 mm mgcl2、1 mm dtt、100 µg/ml bsa。

23、可选地，在步骤s20中，孵育的时间为15~60 min；和/或，

24、孵育的温度为35~40℃。

25、可选地，在步骤s20中，获取所述待测样品的方法包括：取体液样品加入naoh溶液，裂解、提取、浓缩后，得待测样品。

26、可选地，所述体液样品包括痰液、唾液、口腔拭子、肺泡灌洗液、脑脊液中的任意一种。

27、本还发明提出一种如前述的基于crispr/cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法在检测目标基因序列中的应用。

28、本发明提供的技术方案中，通过采用非常规grna，调控cas蛋白的顺式和反式切割活性，在保持相对高反式切割活性的同时，降低顺式切割活性，从而调和检测过程中恒温扩增反应介导的靶基因扩增与crispr反应介导的靶基因耗竭的拮抗作用，进而提高检测效率，实现高效地核酸一步crispr检测。

技术特征：

1.一种基于crispr/cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法，用于检测待测样品中的目标基因序列，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的基于crispr/cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法，其特征在于，所述目标基因序列包括is6110、is1081、esxb、gryb、rpob、katg、inha、rpsl、rrs、gyra、gyrb、embb、rfbe、eis或pnca等。

3.如权利要求1所述的基于crispr/cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法，其特征在于，所述目标基因序列为is6110；

4.如权利要求1所述的基于crispr/cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法，其特征在于，所述grna组合物还包括至少一种常规grna；

5.如权利要求1所述的基于crispr/cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法，其特征在于，所述扩增酶体系包括扩增缓冲液、引物对、氯化镁和酶；和/或，

6.如权利要求5所述的基于crispr/cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法，其特征在于，所述酶包括rpa酶，所述扩增缓冲液为rpa缓冲液，所述rpa缓冲液包括50 mm tris、50mm kac、5 mm dtt、10 mm at、2 mm dntps和30 mm磷酸肌酸；和/或，

7.如权利要求1所述的基于crispr/cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法，其特征在于，在步骤s20中，孵育的时间为15~60 min；和/或，

8.如权利要求1所述的基于crispr/cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法，其特征在于，在步骤s20中，获取所述待测样品的方法包括：取体液样品加入naoh溶液，裂解、提取、浓缩后，得待测样品。

9.如权利要求8所述的基于crispr/cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法，其特征在于，所述体液样品包括痰液、唾液、口腔拭子、肺泡灌洗液、脑脊液中的任意一种。

10.如权利要求1-9任一项所述的基于crispr/cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法在检测目标基因序列中的应用。

技术总结
本发明提供一种基于CRISPR/Cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法，用于检测待测样品中的目标基因序列，包括：S10、将反应液A和反应液B混合，得混合溶液；S20、将待测样品加入混合溶液中，孵育后，检测荧光信号，判断是否存在目标基因；反应液A包括扩增酶体系，反应液B包括gRNA组合物、Cas蛋白和信号探针，gRNA组合物包括至少一种非常规gRNA。本发明提供的技术方案中，通过采用非常规gRNA，调控Cas蛋白的顺式和反式切割活性，保持相对高反式切割活性，降低顺式切割活性，以调和检测过程中恒温扩增反应介导的靶基因扩增与CRISPR反应介导的靶基因耗竭的拮抗作用，实现核酸一步CRISPR检测。

技术研发人员：黄震,卢水华,宋喆,刘旭晖,徐鹏,王小敏
受保护的技术使用者：深圳市第三人民医院（深圳市肝病研究所）
技术研发日：
技术公布日：2024/5/9