一种基于三内核双乳液滴可控融合的单细胞PCR装置及运行方法

本发明涉及核酸检测，具体涉及一种基于三内核双乳液滴可控融合的单细胞pcr装置及运行方法。

背景技术：

1、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,pcr)是一种将遗传物质dna进行体外扩增的技术。在经历多次的高温变性(95℃)-低温退火(56℃)-引物延伸(72℃)温度循环后，少量的dna样本可以被大量拷贝复制，最终浓度达到现有的仪器设备可以识别检测的程度。因而在疾病早期诊断、病菌检测和分子生物学研究领域具有重要意义。

2、常规的pcr方法，如终点pcr和荧光定量pcr，一般需要较多的细胞来获取基因拷贝模板，pcr后得到的是多个样本细胞基因表达的平均结果，这样会掩盖个别细胞基因表达的差异。事实上，生物体由大量的具有不同功能和基因表达的细胞组成，并且同一类细胞在生物体不同状态下，也会存在形态和基因表达上的差异。比如在癌症早期阶段，单个的癌变细胞与其他同种的正常细胞在形态、变形性及生理功能上具有明细的差异。因此，在单细胞水平开展基因的扩增(单细胞pcr)研究，这对更进一步了解关键生命过程，如细胞分化和癌症演变等，具有重要的前景和意义。

3、单个细胞中基因含量很低，而基因扩增往往需要很多操作步骤，包括单细胞的获取、裂解和基因扩增等。在这些过程中，基因样本非常容易造成污染和损失，进而导致pcr的失败。为此，迫切需要一种方法能够将单细胞获取、裂解和基因扩增等步骤整合起来，既能保证各个步骤相互独立，互不干扰，又可以方便的依次开展各个操作流程。

4、水包油包水三内核双乳液滴是由外部水相、中间油相和内部水相构成的微小三相流系统，各个内核相互独立，互不干扰，可以避免交叉污染，成为一种优异的微反应载体。尤其是随着液滴微流控技术的发展，三内核双乳液滴的高效制备使得各种基于液滴载体的生化应用成为可能。如果将单个细胞、细胞裂解液和扩增液分别包裹到三内核双乳液滴的内部，并且使得包裹样本细胞和细胞裂解液的内核大于包裹pcr反应液的内核；然后将生成的液滴置于电场下，通过调整交流电场的电压和频率，实现包裹细胞的内核和包裹细胞裂解液的内核先融合，然后融合的内核再与包裹pcr反应液的内核融合；最后调整液滴温度触发单细胞pcr反应，这样就可以解决单细胞pcr中存在的问题和局限性，进而为单细胞pcr方法的发展提供重要技术支持。并且，三内核双乳液滴的核壳结构可以实现液滴中细胞、细胞裂解液和pcr反应液的长期保存，pcr反应可以按需通过液滴内核融合和加热来触发，进而提高单细胞pcr反应和研究的便捷性和高效性。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决上述技术问题，而提供一种基于三内核双乳液滴可控融合的单细胞pcr装置及运行方法。

2、一种基于三内核双乳液滴可控融合的单细胞pcr装置，包括玻璃毛细管芯片和pcr反应载体操控pdms芯片，所述的玻璃毛细管芯片由内相入射管a2、内相入射管b3、内相入射管c4、中间相入射管6、方形玻璃管7和收集管8组成；所述的pcr反应载体操控pdms芯片由加热ito玻璃9、电控融合ito玻璃17和pdms通道19组成；

3、所述的内相入射管a2、内相入射管b3、内相入射管c4、中间相入射管6和收集管8的一端均为锥形结构；所述的中间相入射管6的锥形结构端从方形玻璃管7的左端伸入，所述的收集管8的锥形结构端从方形玻璃管7的右端伸入；所述的内相入射管a2、内相入射管b3和内相入射管c4的锥形结构端从中间相入射管6的左端伸入，且中间相入射管6和收集管8的锥形结构端与方形玻璃管7的中心线重合；

4、所述的内相入射管a2的左端作为细胞稀释液的入口，所述的内相入射管b3的左端作为细胞裂解液的入口，所述的内相入射管c4的左端作为pcr反应液的入口；所述的中间相入射管6的外壁与方形玻璃管7的内壁之间形成的环状入口作为外相溶液的入口；所述的内相入射管a2、内相入射管b3和内相入射管c4的外壁与中间相入射管6的内壁之间形成的入口作为中间相溶液的入口，所述的收集管8的锥形结构端作为三内核双乳液滴的入口，收集管8的另一端作为三内核双乳液滴的出口；

5、所述的加热ito玻璃9的上表面依次加工有微型加热电极a10、微型加热电极b11和微型加热电极c12，且微型加热电极a10、微型加热电极b11和微型加热电极c12的两端均连接有直流电源；所述的微型加热电极a10、微型加热电极b11和微型加热电极c12的上表面设置有电控融合ito玻璃17，所述的电控融合ito玻璃17的上表面依次加工有等间距排列的高频电控融合电极a13、低频电控融合电极a14、高频电控融合电极b15和低频电控融合电极b16，且均处于pdms通道19入口处的直管路下面，高频电控融合电极a13和高频电控融合电极b15的两端均连接有高频率交流电源，低频电控融合电极a14和低频电控融合电极b16的两端均连接有低频率交流电源；

6、所述的收集管8的出口与pdms通道19的入口连通，所述的pdms通道19的出口作为最终融合内核207的出口。

7、一种基于三内核双乳液滴可控融合的单细胞pcr装置的运行方法，按以下步骤进行：

8、步骤1：将样本细胞充分稀释获得细胞稀释液，并将细胞稀释液以90μl/h的流速从内相入射管a2的左端注入，将细胞裂解液以130μl/h的流速从内相入射管b3的左端注入，将pcr反应液以50μl/h的流速从内相入射管c4的左端注入；使用平头针5将中间相溶液201经中间相溶液的入口注入，同时使用平头针5将外相溶液经外相溶液的入口注入；

9、步骤2：细胞稀释液、pcr反应液和细胞裂解液在中间相溶液201的剪切作用和自身流体表面张力作用下，分别生成细胞稀释液内核202、pcr反应液内核203和细胞裂解液内核205，且细胞稀释液内核202内含有至多一个样本细胞204；细胞稀释液内核202、pcr反应液内核203和细胞裂解液内核205在中间相溶液201的推动下到达中间相入射管6的锥形结构端的出口处，进一步在外相溶液和自身流体表面张力作用下，生成包含三个内核的三内核双乳液滴；

10、步骤3：先将步骤2中得到的三内核双乳液滴依次经收集管8和软管18进入pcr反应载体操控pdms芯片，三内核双乳液滴在pdms芯片中依次流经高频电控融合电极a13、低频电控融合电极a14、高频电控融合电极b15和低频电控融合电极b16，在高频电控融合电极的两端连接高频交流电，并设置电场频率为1mhz及幅值为18.6～18.8v，在低频电控融合电极的两端连接低频交流电，并设置电场频率为80khz及幅值为18.6～18.8v；

11、三内核双乳液滴到达高频电控融合电极a13附近时，三内核双乳液滴内体积大的细胞稀释液内核202和细胞裂解液内核205在高频交流电的作用下，液滴发生旋转，完成液滴的选择性定向；然后液滴流向低频电控融合电极a14，在低频交流电场中，两个大尺寸内核之间在偶极子互动吸引力的作用下发生融合，生成第一阶段融合内核206，且在第一阶段融合内核206中样本细胞受到细胞裂解液的影响发生裂解并释放内部的遗传信息；

12、第一阶段融合内核206流经高频电控融合电极b15时，液滴内部剩余的第一阶段融合内核206与pcr反应液内核203两端在高频率交流电作用下，液滴再次发生选择性定向；随后流经低频电控融合电极b16时，在低频交流电场中，第一阶段融合内核206与pcr反应液内核203发生融合，生成最终融合内核207即具备pcr反应条件的单内核双乳液滴；

13、步骤4：分别驱动微型加热电极a10、微型加热电极b11和微型加热电极c12升温至92～95℃、56～60℃和72℃，最终融合内核207在外相溶液的推动下，依次流经上述三个温度区域，不断重复高温变性、低温退火和适温延伸三个阶段，最终完成pcr反应。

14、本发明的创新点：

15、本发明的创新点在于分别将样本细胞的细胞稀释液及细胞裂解液和细胞稀释液作为内相溶液生成三个内核大小不一的双乳液滴，操控交流电场按照内核大小顺序先后触发细胞稀释液内核与细胞裂解液内核和细胞稀释液的内核融合，使双乳液滴逐步具备pcr反应条件，并进一步通过高温变性(92～95℃)、低温退火(56～60℃)和适温延伸(72℃)三个阶段的加热循环，在双乳液滴独特的核—壳结构中实现液滴数字pcr精准化检测。

16、本发明的有益效果：

17、(1)本发明通过精密注射泵控制三个内核、中间油相和外部水相的流量，利用上述玻璃毛细管芯片生成包含细胞稀释液内核、细胞裂解液内核和pcr反应液内核的三内核双乳液滴单细胞pcr反应载体，并且使得前两个内核大于第三个内核。玻璃毛细管收集所得的液滴悬浮液通过注射泵注入pcr反应载体操控芯片中，在底部电控融合电极上施加特定大小和频率的交流电信号，实现三个内核的顺序电融合，完成单细胞的裂解及与pcr反应液的混合过程。融合后的液滴多次通过芯片的加热区触发pcr反应。其中pcr反应液内核中含有混合引物-探针对，扩增结束后，通过观察反应结束后液滴中的荧光强度变化，反映原始细胞中发生病变的细胞定量，对解决现有pcr技术掩盖了个别细胞基因表达差异和反应时间长的问题具有重要意义。

18、(2)针对现有常规pcr技术掩盖了个别细胞基因表达差异和单细胞pcr方法存在操作效率低、基因样本易污染和丢失的瓶颈问题，本发明公开一种基于三内核双乳液滴可控融合的单细胞pcr方法，将三内核双乳液滴作为单细胞pcr反应载体，利用毛细玻璃管芯片将单个细胞、细胞裂解液和pcr反应液分别包裹到双乳液滴的三个内核中，通过电场触发三个内核的顺序融合，实现细胞裂解及与pcr反应液的混合过程；然后通过温度操控单元实现pcr反应，进而实现高效的单细胞pcr反应。在整个过程中，液滴三个内核相互独立并可以顺序融合触发反应，避免了样本的丢失和交叉污染，有效避免细胞之间基因的相互污染，同时防止碱性细胞裂解液抑制pcr反应液作用，使细胞在反应全过程中个体差异都显著保持。

19、(3)本发明将单个细胞进行pcr反应的环境使用双乳液滴特有的核—壳结构进行隔离和后续可控融合操作，以此开发一种基于液滴微流控的可对单细胞之间进行对比检测的单细胞pcr方法，进而实现单个细胞基因的高效扩增检测。

20、本发明可获得一种基于三内核双乳液滴可控融合的单细胞pcr装置及运行方法。